慢性飲酒對(duì)小鼠膽紅素清除及結(jié)構(gòu)型雄甾烷受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　研究酒精性肝病模型小鼠肝內(nèi)外膽紅素清除通路變化以及膽紅素代謝調(diào)控因子結(jié)構(gòu)型雄甾烷受體的表達(dá)情況，探索CAR激活對(duì)ALD小鼠膽紅素清除的作用，探討慢性酒精攝入對(duì)膽紅素清除的作用與CAR可能的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.酒精組和對(duì)照組小鼠分別喂以Lieber-DeCarli液體酒精(w/v)飼料以及等熱卡的對(duì)照飲食，構(gòu)建酒精性肝病模型小鼠。酒精組小鼠腹腔注射CAR激動(dòng)劑苯巴比妥（DMSO溶解）或DMSO（陰性

2、對(duì)照），即分為對(duì)照組、酒精組、酒精+PB組、酒精+DMSO組。
　　2.摘眼球取血，檢測(cè)ALT、AST、ALP、總膽紅素、直接膽紅素等生化指標(biāo)。
　　3.切取部分肝組織，行蘇木精-伊紅染色(H&E)及油紅染色，觀察肝組織病理變化。
　　4.采用蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)膽紅素肝內(nèi)及肝外清除通路OATP1A1、OATP1A4、OATP1B2、UGT1A1、MRP2表達(dá)以及結(jié)構(gòu)型雄甾烷受體CAR核內(nèi)蛋白及

3、總蛋白的表達(dá)。
　　5.采用Trizol提取肝腎總RNA，RT-PCR檢測(cè)膽紅素清除通路Oatp1a1，Oatp1a4, Oatp1b2, Ugt1a1，Mrp以及結(jié)構(gòu)型雄烷受體Car mRNA表達(dá).
　　6.培養(yǎng)正常小鼠肝細(xì)胞系NCTC1469，取相同代數(shù)的肝細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、酒精組、PB組、PB+酒精組。采用免疫熒光法觀察CAR在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立酒精性肝病小鼠模型，檢測(cè)血清生

4、化指標(biāo)示:與對(duì)照組相比，酒精組ALT、AST、ALP、膽紅素均升高(P值均＜0.05);PB激活CAR后，與酒精+DMSO陰性對(duì)照相比，酒精+PB組總膽紅素水平下降（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　2.H&E、油紅染色可見(jiàn)酒精組肝細(xì)胞腫大，氣球樣變，細(xì)胞核固縮，肝細(xì)胞大皰性、小皰性脂肪變性，酒精+PB組脂肪變性等病理?yè)p傷顯著改善。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，酒精組肝腎0ATP1A1、肝MRP2 mR

5、NA表達(dá)顯著減少，葡萄糖醛酸化酶UGT1A1 mRNA表達(dá)增多(P＜0.05);與陰性對(duì)照組相比，酒精+PB組肝內(nèi)Oatp1a1，Oatp1 a4, Ugt1a1的mRNA表達(dá)明顯增多（P值均＜0.05），腎臟OATP1A1，OATP1A4，MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA改變均不明顯（P值均＞0.05）。
　　4.Western blot結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較，酒精組肝腎OATP1A1、肝MRP2蛋白表達(dá)顯著減少，葡萄糖醛酸化酶UGT1A

6、1蛋白表達(dá)增多（P＜0.05），肝CAR總蛋白未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)，而CAR核蛋白明顯抑制，其表達(dá)量是對(duì)照組的60％（P＜0.05）;與陰性對(duì)照組相比，酒精+PB組肝內(nèi)UGT1A1蛋白表達(dá)顯著增加，是陰性對(duì)照組的2倍（P＜0.05）。腎臟OATP1A1，OATP1A4，MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白改變均不明顯（P＞0.05），肝CAR總蛋白未發(fā)生改變，而肝CAR核蛋白表達(dá)增多，增加1.6倍(P＜0.05)。
　　4.免疫熒光法檢測(cè)C

7、AR在細(xì)胞內(nèi)的分布，結(jié)果示:與空白對(duì)照組相比，酒精組細(xì)胞核內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度較低。PB組細(xì)胞核內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度顯著增加，PB+酒精組細(xì)胞核內(nèi)的紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　1.長(zhǎng)期慢性飲酒導(dǎo)致膽紅素清除障礙，誘導(dǎo)UGT1A1表達(dá)，抑制肝腎膽紅素相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體OATP1A1、肝MRP2表達(dá)，其中抑制作用可能與膽紅素調(diào)控因子CAR核內(nèi)轉(zhuǎn)位損傷有關(guān)。
　　2.CAR激活劑PB調(diào)控CAR進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)ALD小鼠膽紅素清除