TC-1介導TRE17癌基因誘導的人MCF-7乳腺癌細胞遷移.pdf

1、目的：
　　TRE17(也稱為TRE2或USP6)癌基因最早發(fā)現(xiàn)于人Ewing肉瘤，高表達于平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤和乳腺癌等，能使正常成纖維細胞NIH3T3發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。本實驗主要探討TRE17通過TC-1上調(diào)Wnt/β-catenin信號促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移的分子機制，以進一步闡釋癌基因TRE17在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　1.為了研究TRE17高表達對乳腺癌MCF

2、-7細胞遷移的影響，我們將Flag-TRE17和空載體Flag-pcDNA3.0質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MCF-7和HEK293細胞，應(yīng)用Transwell遷移實驗和劃痕實驗分析TRE17高表達對細胞遷移能力的影響。
　　2.為了探討TRE17影響細胞遷移能力的機制，我們采用基因芯片技術(shù)篩選TRE17高表達的差異表達基因。以Flag空載體為對照，用癌基因TRE17轉(zhuǎn)染人MCF7乳腺癌細胞，對照和實驗各送2例進行基因芯片檢測，基因芯片結(jié)果提示，

3、TRE17轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞中差異表達基因上調(diào)的多達404種，本實驗室對上調(diào)倍數(shù)較高的基因進行驗證實驗，其中，用RealTime-PCR和WesternBlot方法觀察了TRE17癌基因高表達對MCF-7細胞TC-1mRNA和蛋白水平的影響。TRE17是由USP32和TBC1D3融合而成。為了進一步明確TRE17各結(jié)構(gòu)域在其調(diào)節(jié)MCF-7細胞TC-1表達中的作用，我們用TBC結(jié)構(gòu)域部分缺失突變體Flag-TRE17(△59-116)、Fl

4、ag-TRE17(△117-174)和鈣調(diào)蛋白（Camodulin，CaM）結(jié)合位點突變體Flag-TRE17(F328E)、USP結(jié)構(gòu)域中USP活性位點突變體Flag-TRE17(-USP)及Flag-TRE17分別轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，用Western blot方法檢測細胞裂解物中TC-1蛋白水平。
　　3.TC-1高表達能使人正常乳腺上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞，但對乳腺癌細胞遷移性是否有影響還未見報道。為了觀察TC-1在乳腺癌

5、MCF-7細胞遷移中的作用，我們構(gòu)建了TC-1真核表達質(zhì)粒:從MCF-7細胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增TC-1 cDNA全長開放讀碼框架(open readingframe，ORF)，并插入真核表達載體Flag-pcDNA3.0中，構(gòu)建了TC-1真核表達質(zhì)粒Flag-TC-1/pcDNA3.0;將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人MCF-7細胞，進行Western blot分析，鑒定重組質(zhì)粒融合蛋白Flag-TC-1表達;將空載體和重組質(zhì)粒分別

6、轉(zhuǎn)染MCF-7、BT549細胞，進行Transwell遷移實驗和劃痕實驗，分析TC-1高表達在乳腺癌遷移中的作用。
　　4.為了明確TC-1在TRE17影響的MCF-7細胞遷移中的作用，我們構(gòu)建了靶向人TC-1基因不同部位的TC-1 shRNA慢病毒載體TC-1(653) shRNA、TC-1(1512) shRNA和TC-1(1566) shRNA及對照慢病毒載體NC shRNA，分別感染MCF-7細胞系，用Western bl

7、ot檢測TC-1蛋白表達水平，明確TC-1特異性shRNA的有效性;隨后，以Flag空載體為對照，用Flag-TRE17分別轉(zhuǎn)染NC shRNA或TC-1(1566) shRNA感染的MCF-7細胞，進行Transwell遷移實驗。已有研究表明TC-1癌蛋白能增強Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因（包括細胞遷移相關(guān)基因）轉(zhuǎn)錄。為了探討Wnt/β-catenin信號通路在TRE17影響MCF-7細胞遷移中的作用，我們用Wnt/β

8、-catenin信號通路抑制劑XAV-939處理MCF-7，并進行Transwell遷移實驗。
　　結(jié)果：
　　1.為探討TRE17癌基因表達對細胞遷移的影響，我們進行了Transwell小室細胞遷移實驗。結(jié)果顯示，用Flag-TRE17轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞遷移數(shù)顯著多于用Flag空載體轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞遷移數(shù);與此相似，TRE17高表達的HEK293細胞遷移能力也明顯強于對照組HEK293-Flag。細胞劃痕實驗結(jié)果同樣

9、顯示，高表達TRE17的MCF-7細胞遷移能力明顯增強。這些結(jié)果表明，TRE17高表達促進細胞遷移。
　　2.為了深入研究TRE17促進細胞遷移的分子機制，我們用基因芯片技術(shù)篩選了TRE17在MCF-7細胞中高表達的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)TRE17轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞中差異表達基因多達404種。在用FLAG-pcDNA3.0空載質(zhì)粒和FLAG-TRE17-pcDNA3.0重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，提取細胞總RNA后，用Real-Ti

10、me RT-PCR方法對某些差異表達基因進行了驗證實驗，其中，高表達TRE17的人MCF7乳腺癌細胞中TC-1 mRNA表達增加2倍以上。用Western blot方法進行研究的結(jié)果顯示，F(xiàn)lag轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞中內(nèi)源性TC-1蛋白水平較低，而用TRE17轉(zhuǎn)染的細胞中TC-1蛋白表達顯著增加。這些結(jié)果表明，TRE17高表達能促進MCF-7細胞中TC-1基因mRNA和蛋白表達。用TBC結(jié)構(gòu)域部分缺失突變體Flag-TRE17(△59-

11、116)、Flag-TRE17(△117-174)和鈣調(diào)蛋白(Camodulin，CaM)結(jié)合位點突變體Flag-TRE17(F328E)、USP結(jié)構(gòu)域中USP活性位點突變體Flag-TRE17(-USP)及Flag-TRE17和空載體Flag-pcDNA3.0進行研究的結(jié)果顯示，與空載體對照相比，F(xiàn)lag-TRE17及突變體Flag-TRE17(F328E)和Flag-TRE17(-USP)高表達均能增加MCF-7細胞中TC-1蛋白水

12、平，但TBC結(jié)構(gòu)域部分缺失突變體Flag-TRE17(△59-116)和Flag-TRE17(△117-174)喪失了促進TC-1蛋白表達的作用。這些結(jié)果提示，TRE17促進MCF-7細胞TC-1表達的作用依賴于其TBC結(jié)構(gòu)域，但不依賴于USP結(jié)構(gòu)域，而CaM結(jié)合與否并不影響TRE17刺激TC-1表達的作用。
　　3.為了探討TC-1高表達對乳腺癌MCF-7細胞遷移的影響，我們用RT-PCR方法克隆了的人TC-1 cDNA完整OR

13、F，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)1條337bp左右的DNA條帶，大小與預期相符?；厥盏脑揜T-PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳和回收純化后，與經(jīng)同樣雙酶切的真核表達載體Flag-pcDNA3.0質(zhì)粒連接，生成重組質(zhì)粒Flag-TC-1-pcDNA3.0。該質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切時出現(xiàn)327 bp特征性片段;DNA序列測定證實序列無誤。隨后，用Flag-pcDNA3.0空載體和Flag-TC-1-pcDNA3.0

14、重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人MCF-7乳腺癌細胞，進行Transwell遷移實驗，結(jié)果顯示TC-1高表達的MCF-7細胞遷移能力明顯強于對照組MCF-7-Flag。與此相似，用人BT549乳腺癌細胞進行劃痕實驗的結(jié)果顯示，在劃痕后12小時，空載體轉(zhuǎn)染的BT549細胞的劃痕大小幾乎無明顯變化，而TC-1轉(zhuǎn)染細胞的劃痕已縮小近50％;在24小時后，空載體對照細胞的劃痕大小僅縮小不到三分之一，而高表達TC-1的BT549癌細胞的劃痕已接近消失。這些結(jié)果

15、表明，TC-1高表達能增強人乳腺癌細胞的遷移性。
　　4.為了明確TC-1在TRE17誘導的MCF-7細胞遷移中的作用，我們以Flag空載體為對照，用Flag-TRE17分別轉(zhuǎn)染NC shRNA對照或特異性抑制TC-1表達的shRNA慢病毒載體TC-1(1566) shRNA感染的MCF-7細胞，進行Transwell遷移實驗。結(jié)果顯示，在細胞內(nèi)TC-1蛋白水平未被敲低時，TRE17癌蛋白高表達顯著增加MCF-7細胞遷移;而用RN

16、A干擾技術(shù)敲低TC-1后，既能抑制TRE17未高表達的MCF-7細胞遷移，也能抑制TRE17高表達誘導的MCF-7遷移，各組之間有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。這些結(jié)果提示，TC-1癌蛋白調(diào)節(jié)人MCF-7乳腺癌細胞遷移，并且至少部分介導TRE17癌蛋白誘導的MCF-7細胞遷移。用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV-939處理MCF-7的Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，TRE17和TC-1癌蛋白分別高表達均能促進MCF-

17、7細胞遷移，而加入藥物XAV-939抑制Wnt/β-catenin信號通路后，不僅轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細胞遷移明顯減弱，而且TRE17和TC-1促進MCF-7細胞遷移的作用也喪失(P＜0.05)。這些結(jié)果提示，TRE17可能通過TC-1/Wnt/β-catenin信號通路促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移。
　　結(jié)論：
　　1、TRE17高表達能促進人MCF-7乳腺癌細胞遷移;
　　2、在人MCF-7細胞中，TRE17癌