金復康基于過表達CXCR4調控骨髓間充質干細胞向肺腺癌淋巴管內皮細胞轉化的研究.pdf

1、目的:本課題在既往研究的基礎上，構建小鼠C-X-C型趨化因子受體4(C-X-C chemokinereceptor type4，Cxcr4)基因的慢病毒過表達載體，經(jīng)體外轉染小鼠骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSCs)，并與免疫磁珠法分選獲得小鼠造血干細胞(Hematopoieticstem cell，HSCs)共移植，重建小鼠骨髓嵌合體模型，探討過表達CXCR4對MSCs歸巢的影響，以及對整個小鼠骨髓造

2、血系統(tǒng)恢復的影響。成功造模后，構建嵌合體小鼠Lewis肺癌模型，聯(lián)合金復康口服給藥，探討過表達CXCR4-MSCs后，腫瘤組織、瘤周組織淋巴管形成情況及腫瘤生長情況，明確金復康基于過表達CXCR4調控淋巴管新生以達到抗腫瘤作用。
　　方法:(1)觀察小鼠骨髓間充質干細胞在體外不同培養(yǎng)條件下的生長情況，每日細胞計數(shù)繪制其生長曲線，MTT法測其OD值，流式細胞術檢測其純度。(2) CD117+免疫磁珠法分選小鼠骨髓造血干細胞，流式細胞

3、術檢測其分選效率。(3)摸索慢病毒過表達CXCR4轉染MSCs的最佳MOI值，流式細胞術檢測其轉染效率。(4)以C57BL/6小鼠雄鼠為供體，雌鼠為受體，建立同基因小鼠骨髓嵌合體模型，受鼠接受TBI(總劑量為8Gy，2Gy/min，視野30×30cm)后隨機分為5組:過表達CXCR4-MSCs+金復康組、過表達CXCR4-MSCs+環(huán)磷酰胺組、過表達CXCR4-MSCs+生理鹽水組、過表達空載-MSCs+金復康組、過表達空載-MSCs+

4、生理鹽水組。造模成功后，進行外周血、骨髓涂片，激光共聚焦顯微鏡下觀察紅色熒光表達情況，過表達CXCR4對MSCs歸巢的影響;同時檢測外周血白細胞、紅細胞、血小板的恢復情況，觀察其對小鼠骨髓造血系統(tǒng)恢復的影響。(5)小鼠骨髓嵌合體模型造模成功35天后，于右腋皮下注射Lewis肺癌細胞（1×107/ml/只），構建嵌合體小鼠Lewis肺癌模型，1周后行金復康灌胃注射（0.4ml/只，相當于給藥量60g/kg/d）、環(huán)磷酰胺腹腔注射（20mg

5、/kg/只），生理鹽水灌胃注射（0.4ml/只）。28天后全部處死小鼠，取出腫瘤組織稱重、冰凍切片、免疫熒光染色，淋巴管內皮經(jīng)LYVE-1抗體標記為綠色，DAPI標記細胞核為藍色，觀察過表達CXCR4后新生淋巴管中紅色熒光、綠色熒光及Merge后的熒光表達情況;觀察應用金復康后，腫瘤組織的生長及變化情況。
　　結果:(1)利用全骨髓培養(yǎng)法可成功獲取高純度的小鼠骨髓MSCs，通過對P3代骨髓MSCs流式鑒定后發(fā)現(xiàn):10％FBS+DM

6、EM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)條件較適宜骨髓MSCs的體外培養(yǎng)，其陽性率分別為CD90.2=42.7％，CD105=98.2％。優(yōu)于10％FBS+DMEM組(CD90.2=19.8％, CD105=95％)和15％FBS+DMEM組(CD90.2=21.3％, CD105=95.7％)。
　　(2) CD117+免疫磁珠法能成功分選出高純度的小鼠骨髓HSCs，流式鑒定結果顯示，與未分選前相比（陽性率1.1％），利用MACS分選后，可顯

7、著提高其分選效率（陽性率54.5％）。
　　(3)成功將慢病毒過表達CXCR4轉染了P3代MSCs，確定了轉染的最佳MOI為40，流式檢測其MSCs上CXCR4含量，與慢病毒NC-MSCs組相比（陽性率12.5％），慢病毒LV-CXCR4-MSCs后，獲得了高轉染效率（陽性率71.5％）。(4)成功構建了小鼠骨髓嵌合體模型，通過對其外周血、骨髓涂片后發(fā)現(xiàn)，激光共聚焦顯微鏡下觀察到骨髓間充質干細胞分化、遷移而來的紅色熒光細胞，且與未

8、過表達組相比，過表達組紅色熒光含量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(5)慢病毒過表達CXCR4后，小鼠外周血白細胞、紅細胞、血小板恢復明顯增快，與未過表達組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(6)嵌合體小鼠Lewis肺癌模型構建成功后，取出腫瘤稱重統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，慢病毒過表達CXCR4后，腫瘤組織均明顯增大，與其他各組相比，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而口服應用金復康后腫瘤組織均明顯小于未口服金復康組，差異

9、具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(7)慢病毒過表達CXCR4后，新生淋巴管中紅色熒光表達明顯增多，其中部分新生淋巴管組織可表現(xiàn)為RFP/LYVE-1(GFP)雙陽性。通過計算平均標準轉化率后發(fā)現(xiàn)，過表達各組中平均標準轉化率明顯高于其他各組(P＜0.05)，而口服金復康后，金復康組中平均標準轉化率顯著低于過表達組(P＜0.05)。
　　結論:(1)體外成功培養(yǎng)出高純度的小鼠骨髓間充質干細胞，并于免疫磁珠法分選獲得的造血干細胞共移植后

10、，成功構建了小鼠骨髓嵌合體模型。(2)慢病毒過表達CXCR4-MSCs后，可促進MSCs的歸巢、同時促進了嵌合體小鼠骨髓造血系統(tǒng)的恢復。(3)慢病毒過表達CXCR4-MSCs后促進了MSCs遷移至肺腫瘤組織且參與了腫瘤組織的淋巴管新生，同時促進了腫瘤組織的生長。(4)金復康口服液對Lewis肺腫瘤組織生長具有明顯抑制作用，其機制可能是通過抑制骨髓間充質干細胞向淋巴管內皮細胞轉化而達到抗腫瘤作用，而SDF-1/CXCR4可能是其通路之一。