人間充質干細胞的增殖調控機制及體外擴增技術的優(yōu)化策略研究.pdf

1、間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種擁有自我更新和多向分化能力的多能干細胞，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，在骨髓、脂肪、滑膜、臍帶、肌肉等多種成體組織中都有存在，在特定的條件下可誘導分化為外胚層、中胚層、內胚層三個胚層的多種細胞，與胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)相比，擁有取材方便、無免疫排斥反應、不存在倫理爭議等優(yōu)點，是組織工程和再生醫(yī)學中一種較為理想的種子細胞

2、。MSCs可以通過體外直接原代培養(yǎng)的方式獲取，但在傳代培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，MSCs會伴隨出現(xiàn)不可逆的復制性衰老。具體表現(xiàn)為原代培養(yǎng)的MSCs在傳代8～10代后，細胞增殖能力逐漸減弱，生長變得非常緩慢，自我更新能力下降，失去向各系分化的能力。因而，通過原代培養(yǎng)而最終能夠用于細胞治療的MSCs數(shù)量非常有限。
　　骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是最早被發(fā)現(xiàn)并研究的間充質

3、干細胞之一。目前對于BMSCs的研究和報道都比較多，對于其用于臨床方面的研究也是MSCs中最早的，因而有望成為最先應用于臨床治療的MSCs。BMSCs可通過全骨髓法和密度梯度離心等方法從骨髓中進行原代培養(yǎng)，取材較方便，并可通過對其特異性的表達CD29、CD44、CD105等標志物進行分離篩選。
　　多能成體祖細胞(MAPCs)是一種從骨髓間充質干細胞中分離得到的一類多能干細胞，在形態(tài)上MAPCs與早期的ESCs相類似，部分細胞呈現(xiàn)

4、克隆樣生長，增殖能力和分化能力比MSCs更強，具有類似于ESCs的全能分化潛力，可連續(xù)傳代80～120次而不出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。目前有研究認為MAPCs是MSCs下的一個亞型，其培養(yǎng)條件與MSCs基本一致，并能共同表達CD105、SSEA-3等標志物。
　　前期，我們通過ESCs-MAPCs-MSCs全基因組芯片，篩選到了一批差異基因。其中，我們挑選了在MSCs中高表達的mRNA prrx1做為研究對象，該基因編碼的中胚層配對同源蛋白（

5、paired mesoderm homeobox protein1）是間充質的一個標志物，有研究表明prrx1可以直接參與細胞的上皮間充質轉化(EMT)，并且能夠影響腫瘤細胞的增殖能力。
　　臍帶間充質干細胞(Umbilical mesenchymal stem cells，UMSCs)是從臍帶中分離得到的間充質干細胞，與BMSCs相比，UMSCs擁有活力更好，增殖能力更強的優(yōu)點。有研究證實在體外培養(yǎng)過程中，相同培養(yǎng)代數(shù)的UMSC

6、s的倍增時間要明顯短于BMSCs，UMSCs細胞周期G1期與S期的比例要遠高于BMSCs。
　　外泌體(exosomes)是細胞分泌的一種微小囊泡，直徑大約在40～100nm之間。外泌體可以特異性的攜帶細胞所特異表達的活性物質，包括miRNA，mRNA，蛋白質等，通過胞吐與胞吞的方式與其他細胞通訊連接，傳遞所攜帶的活性物質。外泌體作為一種重要的旁分泌手段，可參與影響細胞的增殖、遷移、分化等過程。目前，已有間充質干細胞來源的外泌體促

7、進其他細胞增殖的報道，提示MSCs外泌體內可能含有調控MSCs增殖的關鍵物質。
　　目的:本課題的主要目的在于探索prrx1基因以及早代UMSCs外泌體在影響MSCs增殖中的作用研究，尋找優(yōu)化MSCs的培養(yǎng)體系，籍此來解決MSCs體外培養(yǎng)過程中帶來的增殖減弱的困擾。
　　第一部分:prrx1基因敲減在促MSCs增殖中的作用研究
　　方法:(1)通過ESCs-MAPCs-MSCs全基因組芯片篩選出在不同增殖能力的干細胞中

8、差異表達的基因prrx1。(2)原代培養(yǎng)MSCs，并通過免疫組化實驗鑒定其成骨成軟骨成脂肪誘導分化能力。(3)通過設計prrx1的siRNA轉染MSCs的方式來構建prrx1表達降低的體系，并通過實時定量PCR驗證干擾效率。(4)通過實時定量PCR和免疫熒光實驗檢測增殖相關標志物ki67的表達。(5)通過Edu實驗比較干擾prrx1后Edu摻入水平的差異。(6)通過實時定量PCR比較干擾prrx1后多能性相關基因oct4、sox2、na

9、nog的表達差異。(7)通過實時定量PCR比較干擾prrx1后上皮相關基因cdh1、epcam和間充質相關基因cdh2、vim的表達差異。
　　結果:(1)通過原代培養(yǎng)的MSCs可以成功分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，符合MSCs的特征。(2)干擾prrx1基因能夠促進MSCs增殖能力，提高增殖相關標志物ki67表達，并提高Edu摻入比例。(3)干擾prrx1基因能夠促進MSCs自我更新能力，促進干細胞多能相關基因oct4、so

10、x2、nanog的表達。(4)干擾prrx1基因能夠促進上皮相關基因cdh1、epcam的表達，但不能降低間充質相關基因cdh2、vim的表達，且不能使細胞發(fā)生形態(tài)上的改變。
　　結論:prrx1基因是MSCs區(qū)別于MAPCs、ESCs高表達的基因。干擾prrx1表達可以促進MSCs的增殖能力，提高MSCs的自我更新能力。但不能使MSCs發(fā)生MET轉化。
　　第二部分:UMSCs早代外泌體在促BMSCs增殖中的作用研究

11、>　　方法:(1)原代培養(yǎng)UMSCs，用超速離心法收集早代UMSCs的外泌體（第二代和第三代）(2)通過納米粒子分析系統(tǒng)和微流式成像系統(tǒng)對外泌體進行鑒定。(3)通過細胞周期實驗、細胞生長曲線、Edu實驗檢測加入P2和P3代外泌體后BMSCs增殖能力的改變。
　　結果:(1)納米粒子分析系統(tǒng)和微流式成像系統(tǒng)證實超速離心法得到的外泌體在大小上和能夠表達特異標志物方面符合外泌體的描述。(2)P2代外泌體可以促進BMSCs的增殖，增加細胞

12、周期S期的比例，提高Edu的摻入率，增加細胞的數(shù)量。
　　結論:超速離心法是一種簡單有效的提取外泌體的方法。UMSCs早代的外泌體可以促進BMSCs的增殖能力，并且促進BMSCs增殖的活性物質可能存在于第二代UMSCs的外泌體中。
　　第三部分: P2代外泌體中的促增殖成分鑒定與功能研究
　　方法:(1)將收集的P2代及P3代外泌體進行SDS-PAGE電泳，通過銀染結果選擇差異亮度的條帶送于蛋白質質譜檢測，并對結果進行

13、生物信息學分析。(2)將收集的P2代及P3代外泌體送于細胞因子蛋白質芯片，選取差異表達蛋白進行生物信息學分析。(3)對選取出的差異表達蛋白進行ELISA實驗驗證。(4)通過Edu實驗檢測在加入P2代UMSCs外泌體的同時加入CCR2抑制劑，對BMSCs Edu摻入水平的改變。
　　結果:(1)質譜結果顯示外泌體中絕大部分成分是角蛋白和微管蛋白。(2)細胞因子蛋白質芯片篩選出了P2代中高表達的增殖相關的蛋白CCR1和CCR2。(3)