HDAC1對分娩啟動前后人子宮平滑肌細胞PR影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　人類的妊娠和分娩是極其復雜的生理過程。妊娠子宮平滑肌由靜息轉變?yōu)榕d奮收縮狀態(tài)啟動分娩，其具體機制尚不明確，目前仍是臨床研究熱點之一。孕激素是維持妊娠子宮平滑肌處于靜息即舒張狀態(tài)的重要激素，當孕激素的這種功能被阻斷后分娩發(fā)生。人類不同于大多數(shù)靈長類的是分娩啟動時母體血漿孕激素水平并未下降，仍然維持高水平。研究發(fā)現(xiàn)孕激素受體(PR)阻斷劑，例如RU486，卻可以使妊娠子宮收縮導致分娩，于是人們提出了“功能性孕激素撤退”來解

2、釋人類和部分靈長類的分娩啟動機制。目前研究認為眾多“功能性孕激素撤退”的原因中重要因素之一是:孕激素受體亞型(PRs)表達失調，導致子宮對孕激素敏感性降低。
　　PR基因位于11q22-23，含8個外顯子，長度大約90kb，主要有PRA、PRB兩種亞型。PRA基因是PRB的縮短版，其N端缺少164個氨基酸，PRA、PRB亞型的表達由來自于單個基因轉錄而來的兩個獨立的啟動子控制，因此PRA和PRB功能不同:PRB作為PR基因全長版本

3、受體，介導孕激素的大多數(shù)作用，比如維系子宮處于靜息狀態(tài)，而PRA則抑制PRB此種功能。近期大量研究表明人類妊娠晚期相對于PRB，PRA表達上升，PRA/PRB相對比值上升進而啟動分娩，產程開始。然而調節(jié)PR亞型發(fā)生此種改變的機制尚不清楚。
　　近來有研究發(fā)現(xiàn)妊娠晚期子宮平滑肌組織，相比于PRB，PRA啟動子區(qū)乙?；斤@著升高，這給表觀遺傳學調控“孕激素功能性撤退”提供一種可能性。組蛋白乙?；ㄟ^組蛋白乙酰化酶(HATs)和去乙酰

4、化酶(HDACs)改變染色質構象調節(jié)基因轉錄。然而，具體是那些酶作用于PRA基因啟動子，使其乙?；缴呷孕柽M一步研究。同時乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)HDAC，尤其HDAC1，能與雌激素受體(ERα)啟動子結合調節(jié)ER表達。真核生物根據(jù)序列同源性，HDACs家族分為四大類，主要位于細胞核和細胞質，少部分種類位于細胞器。HDACs家族成員結構和生物學功能各不相同，其中人HDAC1屬于Ⅰ類HDACs成員，和酵母Rpd3/Sdi2/Sds6具有同源性

5、。我們前期預實驗分析臨產孕婦子宮發(fā)現(xiàn)伴隨著PRA表達升高，HDACsⅠ類成員HDAC1顯著下降。結合近期國內外研究，我們推測HDAC1可能參與PR調控，通過表觀修飾PR參與分娩發(fā)動過程。因此，我們設計實驗，展開研究。以期初步探索人類分娩啟動的表觀遺傳相關機制，為早產、過期產的預防和治療提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.比較臨產組、未臨產組孕婦子宮平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達，及PRA/PRB值變化。
　　收

6、集臨產組和未臨產組孕婦子宮平滑肌分別為實驗組和對照組，提取組織mRNA和核蛋白，行RT-PCR比較兩組標本HDAC1、PRA和PRB的mRNA水平，計算兩組標本PRA/PRB值，并western blot檢測比較實驗組和對照組三種蛋白的表達水平。
　　2.分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細胞(HUtSMCs)
　　取組織塊用膠原酶消化法分離培養(yǎng)原代細胞，并用免疫熒光法和western blot檢測人妊娠子宮平滑肌蛋白標志物:C

7、alponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC在培養(yǎng)細胞中的表達。
　　3.構建HDAC1干擾(HDAC1-RNAi)質粒和HDAC1過表達質粒
　　英俊公司設計和構建沉默HDAC1表達的HDAC1-RNAi質粒和HDAC1過表達質粒。
　　4.HDAC1干擾質粒和過表達質粒轉染HUtSMCs
　　取P4代HUtSMCs，電穿孔法轉染HDAC1干擾質粒、過表達質粒及空載體質粒。流式細胞儀測質粒轉染效率

8、。
　　5.檢測沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化
　　原代細胞轉染干擾質粒后，RT-PCR分析HDAC1、PRA和PRB的mRNA表達變化，及PRA/PRB比值變化，western blot方法檢測三個基因的蛋白水平變化。
　　6.檢測過表達HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化
　　原代細胞轉染過表達粒后，RT-PCR技術和western blot方法分析HDAC1、PRA和PRB的m

9、RNA和蛋白表達變化，及PRA/PRB比值變化。
　　7.HDAC1調控PRs的機制研究
　　ChIP分析比較干擾組、過表組和對照組HDAC1在PRA、PRB啟動子區(qū)富集量。
　　8.統(tǒng)計學分析
　　采用GraphPad Prism5軟件行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)均先行正態(tài)性檢驗，并以平均值±標準偏差(SD)表示。雙尾Student't檢驗比較兩組間差異。
　　結果：
　　1.比較臨產組、未臨產組孕婦子宮

10、平滑肌組織HDAC1、PRA和PRB的表達，及PRA/PRB值變化。
　　mRNA水平和蛋白水平分析兩組樣本:(1)臨產組PRA的表達顯著高于未臨產組;(2)兩組間PRB的表達水平無顯著統(tǒng)計學差異;(3)臨產組PRA/PRB的值明顯高于未臨產組;(4)臨產組HDAC1的水平明顯降低，低于未臨產組。
　　2.分離、培養(yǎng)和鑒定原代子宮平滑肌細胞(HUtSMCs)
　　倒置顯微鏡下觀察，樣本組織可見典型長梭形肌纖維;原代細胞

11、呈長梭行生長;細胞免疫熒光法和western blot檢測發(fā)現(xiàn)大量人子宮平滑肌蛋白標志物:Calponin、α-SMA、Vimentin、SM-MHC于原代細胞中的表達。
　　3.HDAC1干擾質粒和過表達質粒轉染HUtSMCs
　　免疫熒光顯微鏡及流式細胞儀，見實驗組和陰性對照組細胞表達大量綠色熒光，測得質粒轉染效率60％以上。
　　4.檢測沉默HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化
　　干擾HUtSM

12、Cs的HDAC1表達，PRA基因的mRNA和蛋白表達升高;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值升高。
　　5.檢測過表達HDAC1后HDAC1、PRA和PRB表達變化
　　過表達HDAC1，PRA基因的mRNA和蛋白表達降低;PRB基因未見明顯差異。PRA/PRB值下降。
　　6.HDAC1調控PRs的機制研究
　　CHIP檢測發(fā)現(xiàn)，干擾組HDAC1在PRA啟動子區(qū)富集量明顯減少;過表達組，其HDAC1在PR