馬爾尼菲青霉次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：觀察馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7形態(tài)、活力和極化功能的影響，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)角度初步探討馬爾尼菲青霉次級(jí)代謝產(chǎn)物在病原體逃避宿主免疫防御中的作用。
　　方法：分離提取PM酵母樣細(xì)胞在DMEM液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)的濾液，培養(yǎng)濾液與巨噬細(xì)胞RAW264.7共同培養(yǎng):(1)光學(xué)顯微鏡觀察PM培養(yǎng)濾液對(duì)巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響。(2)糖原染

2、色（PAS染色）觀察PM培養(yǎng)濾液對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬PM分生孢子能力的影響;(3) WST-8法檢測(cè)PM培養(yǎng)濾液對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性及增殖影響程度;(4) AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PM培養(yǎng)濾液對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡、壞死的影響程度;(5) ELISA法檢測(cè)PM培養(yǎng)濾液對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10）的影響;(6)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)PM培養(yǎng)濾液對(duì)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD16/32、CD206表達(dá)

3、情況的影響。
　　結(jié)果：(1) PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細(xì)胞RAW264.724 h～48 h，巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)密度降低，體積變大，腫脹變圓，部分胞漿內(nèi)見空泡，少許細(xì)胞崩解。(2)10％～50％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細(xì)胞，24 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞吞噬PM分生孢子的吞噬率(％)和吞噬指數(shù)分別為83.687±6.279，5.969±1.170;48h時(shí)，吞噬率(％)和吞噬指數(shù)分別為78.402±5.522，6.602±0.784;24

4、h、48 h吞噬率和吞噬指數(shù)分別與對(duì)照組比較均有顯著升高(P＜0.05)。(3)10％～40％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細(xì)胞24 h、48 h，WST-8檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞OD值分別為0.996±0.152，0.564±0.269，與對(duì)照組比較均有顯著降低（24 h，P＜0.05;48h，P＜0.001）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡壞死:實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞存活細(xì)胞率(％)、凋亡率(％)和壞死率(％)在24 h時(shí)，分別為76.41±10.99，9.

5、13±4.10，11.03±8.34;48 h時(shí)，分別為58.91±21.00，13.18±5.51，18.14±12.73;24h、48 h存活率分別與對(duì)照組比較均有顯著降低（P＜0.05）;凋亡率有顯著升高（P＜0.05）;壞死率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(4)10％～60％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細(xì)胞，24 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10濃度(pg/ml)分別為1807.300±193.75

6、9，4.769±3.736，3.180±1.141，35.431±16.005;與對(duì)照組比較TNF-α、IL-10、IL-12分泌量均有顯著升高(P＜0.05)，IL-1β分泌量顯著減少(P＜0.01)。48 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-10濃度分別為1491.307±695.238，7.153±4.128，4.084±1.631，20.878±11.696，與對(duì)照組比較TNF-α、IL-10分泌量均有顯著升高

7、(P＜0.01)，IL-1β分泌量顯著減少(P＜0.01)，IL-12差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(5)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)觀察20％ PM培養(yǎng)濾液作用于巨噬細(xì)胞，表達(dá)CD206，不表達(dá)CD16/32;巨噬細(xì)胞與PM分生孢子共同培養(yǎng)，同樣僅表達(dá)CD206。
　　結(jié)論：(1) PM培養(yǎng)濾液中含有的次級(jí)代謝產(chǎn)物可以激活巨噬細(xì)胞表達(dá)CD206和分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-10。(2) PM次級(jí)代謝產(chǎn)物作用于巨噬細(xì)胞的早期(24 h～