灰樹花多糖聯(lián)合維生素C誘導肝癌細胞SMMC-7721凋亡與自噬的研究.pdf

1、背景：肝細胞性肝癌是發(fā)病率和死亡率高且預后極差的惡性腫瘤之一。目前臨床的治療方法包括外科手術(shù)切除、TACE術(shù)、放化療、免疫治療、基因治療等，但大多難以控制疾病的進展。化學藥物治療是目前使用最多的方法，但所應用的化療藥物對病人的毒副作用較大且療效不高。因此研發(fā)既有抗癌活性同時毒副作用低的新型抗腫瘤藥物一直是研究的重點。近些年從天然產(chǎn)物中提取有效抗腫瘤活性成分已成為一種新的研究趨勢?；覙浠ǘ嗵牵℅rifola frondosa polysa

2、ccharide。GFP）是從藥食同源菌種灰樹花子實體及菌絲體中提取出的一種具有廣泛藥理作用的活性物質(zhì)。已有研究報道過GFP對腫瘤細胞的增殖具有較顯著的抑制作用，且抗腫瘤效應的分子機制為誘導細胞凋亡。同時維生素C（Vitamin C，VC）也曾被報道過在體外實驗中具有誘導骨肉瘤細胞凋亡和誘導骨髓基質(zhì)細胞自噬的作用。
　　目的：通過對灰樹花多糖抗腫瘤的文獻進行計量學分析，同時對多糖抑瘤效應中凋亡的作用進行Meta分析的研究方法，來了

3、解灰樹花多糖抗腫瘤方面研究的現(xiàn)狀并探討多糖抗腫瘤主要的分子機制，并在此基礎(chǔ)上進行下一步的實驗研究。探討聯(lián)合應用灰樹花多糖和維生素C對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響，驗證二者在抗腫瘤效應上是否具有協(xié)同增效作用，此外闡明凋亡與自噬在聯(lián)合用藥治療肝癌細胞過程中發(fā)揮的作用，并進一步探討聯(lián)合用藥誘導肝癌細胞凋亡和自噬發(fā)生的具體分子機制，為有效指導臨床實踐用藥，開拓臨床治療肝癌新思路提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法：對灰樹花提取物生物活性的相關(guān)

4、研究文獻進行計量學分析，并應用可視化技術(shù)對灰樹花多糖抗腫瘤研究的現(xiàn)狀進行全面的了解。其次通過系統(tǒng)評價與Meta分析的方法對灰樹花多糖抑瘤作用的分子機制進行分析，探討灰樹花多糖抗腫瘤效應中誘導細胞凋亡的作用。隨后進行實驗研究，對于從灰樹花子實體中提取出來的多糖以及常規(guī)藥物維生素C，采用MTT法分別檢測單用藥和聯(lián)合用藥后對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響；應用等效線圖解法研究聯(lián)合用藥時二者之間的相互關(guān)系并尋求最佳聯(lián)合用藥濃度；流式細胞術(shù)

5、檢測聯(lián)合用藥對細胞周期的影響；Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測對細胞凋亡的誘導作用；用倒置生物顯微鏡觀察藥物干預后SMMC-7721細胞形態(tài)學的改變，并進一步用透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)變化；同時用Hoechst33258凋亡熒光染色劑和MDC自噬熒光染色劑對細胞進行處理后，通過熒光顯微鏡觀察細胞凋亡和自噬的發(fā)生情況；應用Western blotting（WB）法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、PARP及自噬相關(guān)蛋白B

6、eclin-1、LC3、Akt和phospho-Akt蛋白的表達情況；通過比較全細胞蛋白和胞質(zhì)蛋白中細胞色素C的表達量來判斷此過程中是否有細胞色素C的釋放；另外分別檢測藥物處理后細胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性變化情況。從分子生物學水平檢測細胞凋亡與自噬水平的改變，并探討此過程中細胞遵循何種信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)生凋亡和自噬。
　　結(jié)果：文獻分析結(jié)果顯示，在對灰樹花提取物生物活性的諸多研究中，灰樹花多糖

7、的抗腫瘤效應一直是研究的重點與熱點，而系統(tǒng)評價和Meta分析結(jié)果表明誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡是其發(fā)揮抑瘤效應的主要機制。實驗結(jié)果顯示，灰樹花多糖和維生素C均可抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖，且呈時間-劑量依賴性。等效線圖解法分析結(jié)果表明小劑量的GFP（<0.6 mg/ml）與VC聯(lián)合應用時，二者具有協(xié)同增效抗腫瘤作用，根據(jù)MTT結(jié)果最終選定聯(lián)合用藥濃度為0.2mg/ml GFP聯(lián)合0.3mM VC，此時聯(lián)合用藥對SMMC-7721細胞抑

8、制率為68.81％±1.12，高于單用GFP（16.03%±1.80）和VC（29.85%±1.02）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示聯(lián)合用藥后細胞發(fā)生G2/M期阻滯，且細胞凋亡率從對照組的3.22%±0.23上升至聯(lián)合用藥組的64.45%±1.41，而聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率分別是GFP組的6.88倍和VC組的2.24倍。藥物處理肝癌細胞24小時后，光學顯微鏡與透射電鏡下均可觀察到細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、胞質(zhì)疏松等早期凋亡現(xiàn)象，同時在

9、胞質(zhì)中可觀察到有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡出現(xiàn)。Hoechst33258染色后，GFP、VC及聯(lián)合用藥處理的細胞中均可觀察到典型的細胞核偏向一側(cè)的凋亡細胞核變化情況。MDC染色后VC與聯(lián)合用藥干預后可在細胞胞質(zhì)中見到熒光加強的自噬顆粒，且凋亡與自噬現(xiàn)象均是聯(lián)合用藥組更加明顯。WB結(jié)果顯示聯(lián)合藥物干預后，與對照組相比，促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降、caspase-3底物PARP表達增強。同時對照組、GFP、VC與聯(lián)合用藥

10、組四個組全細胞蛋白中的細胞色素C表達無差別，而除對照組外其余三個組細胞的胞質(zhì)蛋白中細胞色素C表達增強，說明藥物干預后細胞色素C釋放到胞質(zhì)中。此外，聯(lián)合用藥后細胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均增強。提示聯(lián)合用藥后肝癌細胞SMMC-7721凋亡水平上升，且主要遵循內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)生凋亡。WB結(jié)果同時顯示，聯(lián)合用藥后細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達增強、自噬分子標志物LC3-II表達上調(diào)，LC3-II

11、/LC3-I比例上升，說明細胞自噬活性增強，但在接下來的WB實驗中，細胞總Akt和phospho-Akt蛋白表達均增強，說明經(jīng)典負性調(diào)控的自噬信號轉(zhuǎn)導途徑PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號轉(zhuǎn)導通路可能不參與此過程。
　　結(jié)論：文獻計量學分析結(jié)果表明，灰樹花多糖的抗腫瘤作用一直是其生物活性研究的重點。Meta分析結(jié)果也顯示，多糖抑瘤效應主要的分子機制為誘導腫瘤細胞凋亡。進一步的實驗結(jié)果提示，小劑量的GFP聯(lián)合VC對肝癌細胞