激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細胞泡沫化中作用及機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　動脈粥樣硬化形成以泡沫細胞在血管壁上沉積為特征性病理表現(xiàn)。泡沫細胞的增多促進了粥樣斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性，導(dǎo)致心腦血管事件的發(fā)生。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的首要致病因素。泡沫細胞的主要來源是單核巨噬細胞和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)。早期動脈粥樣硬化病變中的泡沫細胞主要來源于巨噬細胞，而中晚期病變中泡沫細胞主要來源于VSMC（45％為VSMC來源，只有30％

2、呈現(xiàn)巨噬細胞標記）。相比于巨噬細胞性泡沫細胞形成的大量研究，來源于VSMC的泡沫細胞在近年才受到關(guān)注，其形成的具體調(diào)控機制還遠未闡明。
　　泡沫細胞的形成是由于胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量含膽固醇酯核心的脂滴而使得細胞呈現(xiàn)類似泡沫樣的外觀改變。以往認為脂滴的代謝主要在胞漿內(nèi)進行，由系列脂肪水解酶（如脂肪甘油三酯脂肪酶和單?；视椭久傅龋ζ浜诵闹|(zhì)進行分解。最近的研究證實，自噬介導(dǎo)的溶酶體內(nèi)降解也是脂滴分解的重要途徑。尤其是在動脈粥樣硬化這個

3、高脂環(huán)境中，自噬介導(dǎo)的脂滴分解可能較傳統(tǒng)的胞漿分解途徑起著更為重要的作用。更為直接的證據(jù)是在巨噬細胞源性泡沫細胞中，自噬通過溶酶體酸性脂肪酶調(diào)節(jié)膽固醇外流。抑制自噬會增加而誘導(dǎo)自噬會降低細胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集。但是，目前少有研究報道自噬在VSMC泡沫樣變過程中的作用。
　　瞬時受體電位香草醛亞家族1(transient receptor potential vanilloid subfamily1，TRPV1)可被辣椒素激活。TRPV1

4、是非選擇性陽離子通道并且對心腦血管疾病具有保護作用。以往研究顯示TRPV1的激活可以通過減少脂質(zhì)的攝取和增加脂質(zhì)的轉(zhuǎn)出而抑制VSMC泡沫樣變。最近研究表明TRPV1的激活可以誘導(dǎo)肝細胞和胸腺細胞的自噬水平。此外，TRPV1的激活以后可以進一步促進腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)磷酸化，而后者在自噬的調(diào)控中發(fā)揮促進作用。我們設(shè)想，TRPV1的激活可以通過促進AMPK的磷酸化而誘導(dǎo)自噬，

5、進而抑制VSMC的泡沫樣變。
　　為了證實我們的假設(shè)，本研究分為三部分。第一部分探討自噬在VSMC泡沫樣變過程中的作用。利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)誘導(dǎo)原代VSMC泡沫樣變。利用雷帕霉素(rapamycin，Rap)誘導(dǎo)自噬和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）抑制自噬，探討調(diào)控自噬對VSMC泡沫樣變的作用。第二部分分題一在oxLDL誘

6、導(dǎo)的VSMC泡沫樣變模型中加入不同濃度的TRPV1激動劑辣椒素以及利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，探索激活TRPV1對自噬的作用。分題二離體實驗利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，在體實驗利用野生型和TRPV1敲除小鼠喂高脂以及辣椒素，探討激活TRPV1對自噬溶酶體途徑的作用。分題三利用小干擾RNA技術(shù)，敲低自噬關(guān)鍵基因Atg7，探討自噬在TRPV1抑制VSMC泡沫樣變中的作用。第三部分研究TRPV1激活誘導(dǎo)自噬的可能分子機制。

7、利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，oxLDL誘導(dǎo)泡沫樣變，利用AMPK抑制劑compound C，探討激活TRPV1是否通過活化AMPK通路而誘導(dǎo)自噬。
　　材料與方法:
　　離體實驗主要利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主動脈原代培養(yǎng)的VSMC作為研究對象。在體實驗分別利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠隨機分為普高脂組（HFD組）和高脂加辣椒素組（HFD+Cap組）。
　　1.利用組

8、織貼塊法進行原代培養(yǎng)VSMC。
　　2.利用oxLDL刺激VSMC構(gòu)建泡沫細胞模型。
　　3.采用蛋白免疫印跡的分子生物學(xué)技術(shù)，探討自噬相關(guān)蛋白LC3、beclin-1及p62的變化以判斷自噬水平。
　　4.采用油紅O染色檢測泡沫細胞形成，細胞內(nèi)膽固醇檢測分析細胞內(nèi)膽固醇含量。
　　5.利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主動脈進行原代平滑肌細胞的培養(yǎng)，以TRPV1激動劑辣椒素及其特異性拮抗劑作為藥

9、物干預(yù)手段，采用蛋白免疫印跡法檢測主動脈及平滑肌細胞上溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1的變化，采用免疫熒光的方法檢測LAMP1的表達。
　　6.利用轉(zhuǎn)染siRNA技術(shù)，敲低自噬關(guān)鍵蛋白Atg7。
　　7.利用AMPK的抑制劑抑制AMPK的活性，檢測Atg7及LC3的表達。
　　結(jié)果:
　　1.oxLDL呈濃度梯度地誘導(dǎo)VSMC脂質(zhì)聚集，80μg/ml最明顯;80μg/ml oxLDL呈時間依賴性地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的

10、比值、beclin-1的蛋白水平以及升高p62的蛋白水平，刺激24小時后變化最明顯。
　　2.自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可以減少油紅O陽性細胞個數(shù)和細胞內(nèi)總膽固醇的含量，而自噬抑制劑則增加油紅O陽性細胞個數(shù)和細胞內(nèi)膽固醇的含量。
　　3.TRPV1激動劑可呈濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)oxLDL降低的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和beclin-1的蛋白水平，該作用可被TRPV1拮抗劑或TRPV1-/-所抑制。
　　4.激活TRPV1可增加LA

11、MP1的表達，TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加LAMP1的表達。
　　5.激活TRPV1可顯著升高高脂喂養(yǎng)野生型小鼠主動脈LAMP1的表達，而對高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-小鼠LAMP1的表達沒有影響。
　　6.在con siRNA轉(zhuǎn)染的VSMC，TRPV1激動劑可以升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、beclin-1的蛋白水平以及減少油紅O染色陽性細胞數(shù)和細胞內(nèi)膽固醇含量，而對Atg7siRNA轉(zhuǎn)染的VSMC，T

12、RPV1激動劑則沒有顯示出上述效應(yīng)。
　　7.激活TRPV1可增加p-AMPK的表達，TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加p-AMPK的表達;AMPK抑制劑compound C抑制p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Atg7的蛋白表達。
　　結(jié)論:
　　本研究顯示在oxLDL誘導(dǎo)的VSMC泡沫樣變過程自噬水平是受到抑制的;調(diào)控自噬可以調(diào)節(jié)VSMC的泡沫樣變;TRPV1的激活可以通過誘導(dǎo)AMPK磷酸