秦艽轉基因根植株誘導及其龍膽苦苷合成能力的分析.pdf

1、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)為龍膽科(Gentianaceae)多年生草本植物，是我國的傳統中藥材，以根入藥，具有抗風濕解熱鎮(zhèn)痛抑菌等作用。 轉基因根(transgenicroot，TGR)，也叫發(fā)狀根(hairyroot，HR)，是植物受傷部位經發(fā)根農桿菌感染(Agrobateriumrhizogenes)后所誘導產生的一種根狀器官。由于轉基因根不僅可以經過組織培養(yǎng)再生出可能具有某種優(yōu)良性狀的轉基因

2、植株，也可以在液體懸浮培養(yǎng)條件些大量繁殖，并合成一些對人類有用的次生代謝產物，所以被公認為是一種有前途的生產有用次生代謝產物(包括藥用成分)的新途徑。由于近三分之一傳統藥材的藥用部位是根，所以轉基因根研究在傳統藥材生物藥生產中具有更重要的意義。 本研究利用本課題組張慧麗碩士兩年前建立的秦艽轉基因根，通過組織培養(yǎng)方法建立了相應的植株再生體系，探討了不同激素濃度/組合對其植株再生能力的影響，分析再生植株形態(tài)學和龍膽苦苷合成能力。此外

3、，還研究了多種物理化學因素對秦艽轉基因根生物量和龍膽苦苷合成能力的影響。目的是探討通過植株誘導獲得一些高龍膽苦苷合成能力的新品系和通過液體懸浮培養(yǎng)大量合成龍膽苦苷及其他有用次生代謝產物的可能性。主要研究結果如下： (1)在含1.0㎎/l2，4-D+0.5㎎/l6-BA的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天后，100％的TGR外植體均可誘導產生胚性愈傷組織。轉移到無激素的MS固體培養(yǎng)基中14天后，高達94％的胚性愈傷組織可以產生1-12個芽

4、點。經過兩周的培養(yǎng)后，這些芽點可以發(fā)育成與種子苗一樣的小苗。在室外，50％的再生植株可以存活。大部分在室外生長的再生植株與野生型植株相比，它們的葉子呈深綠色、葉面皺縮的橢圓形，氣孔也較為小而密集；再生植株的葉子和根的重量分別比野生型植株的增加6倍和2倍。PCR分析證明這些再生植株的基因組內仍然保留Ri質粒中的rolC基因。HPLC分析結果表明再生植株的根中龍膽苦苷含量要比野生型高74.2％，但是葉子中的含量則要低12.9％。 (

5、2)分析不同理化因對轉基因根生物量和龍膽苦苷合成的影響發(fā)現：(a)光照可以明顯提高秦艽轉基因根生物量和龍膽苦苷的含量。(b)其生物量累積隨蔗糖濃度的升高呈先升后降的趨勢，在30g/l時達到最大值；其龍膽苦苷單位含量則隨蔗糖濃度的升高而總體呈上升趨勢，在40和50g/l的時候達到最大。(c)低的銨/硝態(tài)氮比有利于其生長，隨著銨/硝態(tài)氮比率的升高，其生物量累積隨之減少。當培養(yǎng)基中只有銨鹽的時候則完全抑制了它的生長，而其龍膽苦苷單位含量則隨之

6、升高。當銨鹽由硫酸銨替換為硝酸銨(比率為0.825g/l：1.775g/l)時，最利于其生長，即其生物量累積和龍膽苦苷單位含量在此時都達到最高值。(d)在甘氨酸濃度為0時，秦艽轉基因根也有一定量的生物量累積和龍膽苦苷的合成，但太高和太低的甘氨酸濃度都不利于其生物量的積累，當濃度為1.0㎎/l時，生物量累積達到最大值；在甘氨酸濃度為0.5㎎/l時，其龍膽苦苷單位含量達到最大。(e)由于秦艽轉基因根合成龍膽苦苷的總量受生物量和單位含量的共同