C反應(yīng)蛋白對3T3-L1脂肪細胞總脂聯(lián)素和高分子量多聚體脂聯(lián)素的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、目的：
　　觀察C反應(yīng)蛋白(CRP)對3T3-L1脂肪細胞總脂聯(lián)素(Adiponectin)及各聚體表達的影響，并進一步探討其調(diào)控機制。
　　方法：
　　1.3T3-L1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化成熟后，予 CRP重組蛋白干預(yù)，分別用Real-time PCR觀察總脂聯(lián)素mRNA變化， Western blot方法明確其對脂聯(lián)素以及高分子量脂聯(lián)素蛋白表達的影響。
　　2.細胞免疫熒光方法檢測CRP干預(yù)后，3T3-L1脂肪

2、細胞脂聯(lián)素蛋白表達變化。
　　3.Western blot檢測 CRP刺激后，總脂聯(lián)素及各聚體（低聚體（low-molecular-weight, LMW）、中聚體（middle-molecular-weight, MMW）、高聚體（high-molecular-weight, HMW））表達變化。Real-time PCR檢測脂聯(lián)素多聚化相關(guān)調(diào)控基因Erp44、Ero1-α和DsbA-L表達水平。
　　4.3T3-L1前脂

3、肪細胞誘導(dǎo)分化成熟后，分別加入 CRP、磷脂酰肌醇3酶（ phosphatidylinositol3 kinase, PI-3K）信號通路抑制劑LY294002、蛋白激酶B（PKB/Akt）磷酸化抑制劑T3830，real-time PCR、Western blot等方法，檢測總脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達水平，Western blot方法檢測高分子量多聚體脂聯(lián)素表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.Real-time PCR及Wes

4、tern blot結(jié)果均顯示，作用24h后，5μg/mL CRP對總脂聯(lián)素無明顯影響，25μg/mL CRP對總脂聯(lián)素表達的抑制具有統(tǒng)計學意義，50μg/mL CRP對總脂聯(lián)素的抑制作用更為明顯，呈劑量依賴。50μg/mL CRP干預(yù)6h后，總脂聯(lián)素表達無變化，干預(yù)12h對總脂聯(lián)素產(chǎn)生抑制作用，而24h更明顯，呈時間依賴。
　　2.免疫熒光顯示，50μg/mL顯著抑制3T3-L1脂肪細胞內(nèi)脂聯(lián)素表達。
　　3. Wester

5、n blot結(jié)果顯示，作用24h后，5μg/mL CRP對高分子量多聚體脂聯(lián)素無明顯影響，25μg/mL CRP顯著抑制高分子量多聚體脂聯(lián)素蛋白表達，50μg/mL CRP的抑制作用更為明顯，呈劑量依賴。50μg/mL CRP干預(yù)細胞6h后，高分子量多聚體脂聯(lián)素無明顯變化，12h后，高分子量多聚體脂聯(lián)素蛋白表達顯著降低，24h后更明顯，呈時間依賴。
　　4. Western blot結(jié)果顯示，50μg/mL CRP作用24h后，總

6、脂聯(lián)素表達降低。低聚體無顯著變化，中聚體表達降低，高分子量多聚體表達降低且更為明顯。HMW/total adiponectin比值降低。Real-time PCR顯示，adiponectin多聚化相關(guān)基因Erp44表達上升，Ero1-α與DsbA-L表達下降。
　　5.在3T3-L1脂肪細胞中，分別加入PI3K抑制劑LY294002和Akt磷酸化抑制劑T3830，結(jié)果顯示，均可部分逆轉(zhuǎn)CRP對脂聯(lián)素的抑制作用。
　　結(jié)論：<