多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1調(diào)控精氨酸酶Ⅱ表達及血管內(nèi)皮功能的實驗研究.pdf

1、目的：
　　血管內(nèi)皮功能受損是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。NO維持血管舒張功能、抑制血小板聚集、炎性反應(yīng)，在調(diào)節(jié)血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。在內(nèi)皮細胞中，精氨酸酶Ⅱ(ArginaseⅡ)可與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)競爭其共同底物L(fēng)-精氨酸，從而降低一氧化氮(NO)的生成。精氨酸酶Ⅱ是調(diào)節(jié)NO合成的重要的酶，而oxLDL可通過提高內(nèi)皮細胞中精氨酸酶Ⅱ的活性從而降低內(nèi)皮源性NO的生成，抑制精氨酸酶Ⅱ表達可有效的防止血管內(nèi)皮

2、功能受損及動脈粥樣硬化病變的進展。但精氨酸酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚屬未知。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)是一類DNA修復(fù)酶，可以參與炎性反應(yīng)并直接關(guān)系到細胞存活，影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，還可發(fā)揮廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。我們前期質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP-1)可作為轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域。
　　而PARP-1能否參與調(diào)節(jié)精氨酸酶Ⅱ的活化及內(nèi)皮功能尚屬未知數(shù)。為此我們提出如下假設(shè):

3、1）抑制PARP-1可以降低內(nèi)皮源性的精氨酸酶Ⅱ表達，繼而影響eNOS的活性及NO的生成。2)PARP-1在調(diào)控精氨酸酶Ⅱ的表達及血管內(nèi)皮功能上發(fā)揮了重要作用。
　　基于以上思路，本研究擬用熒光素酶報告、染色質(zhì)免疫共沉淀、蛋白免疫共沉淀等實驗技術(shù)，研究PARP-1在調(diào)控精氨酸酶Ⅱ表達中的作用及其機制，為PARP-1通過介導(dǎo)精氨酸酶Ⅱ影響內(nèi)皮功能提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.質(zhì)粒構(gòu)建及熒光素酶活性的檢測
　　

4、構(gòu)建pGL3載體包含不同位點的精氨酸酶Ⅱ上游啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)染HAECs，熒光素酶報告系統(tǒng)篩選精氨酸酶Ⅱ核心啟動子區(qū)域。
　　2.細胞干預(yù)及處理
　　不同濃度的oxLDL處理HAECs，同時轉(zhuǎn)染PARP-1小干擾RNA，收取細胞蛋白及mRNA進行蛋白印跡及RT-PCR檢測。
　　3.染色質(zhì)免疫沉淀試驗(ChIP)
　　應(yīng)用試劑盒(Millipore)進行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試驗。驗證PARP-1是否與精氨酸酶

5、Ⅱ啟動子活性片段結(jié)合。
　　4.實時定量RT-PCR
　　Trizol法抽提總RNA，檢測PARP-1、精氨酸酶Ⅱ等mRNA水平表達。
　　5.蛋白質(zhì)免疫印跡
　　裂解液提取蛋白。SDS-PAGE電泳檢測PARP-1、精氨酸酶Ⅱ、eNOS等的表達。
　　6.免疫共沉淀
　　為探討PARP-1與磷酸化的ERK1/2的相互作用，進行免疫共沉淀實驗。
　　7.動物實驗及標本檢測
　　檢測ApoE

6、-/-PARP-1-/-、ApoE-/-PARP-1-/-基因敲除小鼠血脂水平，測定主動脈組織及細胞NO含量、精氨酸酶活性，進行血管舒張試驗檢測內(nèi)皮舒張功能。
　　8.免疫細胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)
　　檢測CD31、精氨酸酶Ⅱ及eNOS在HAECs及主動脈中的定位及表達。
　　結(jié)果：
　　1.多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1直接結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域-774～-738 bp位點
　　將包含不同片段的精氨酸酶Ⅱ啟

7、動子的pGL3載體轉(zhuǎn)染進HAECs細胞，并檢測熒光素酶活性表達，篩選出精氨酸酶Ⅱ啟動子核心區(qū)域定位于-774～-738bp。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示，應(yīng)用PARP-1抗體組-774～-738bp區(qū)域可見擴增條帶，PARP-1特異性結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子的-774～-738bp區(qū)域。
　　2.多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1調(diào)控主動脈內(nèi)皮細胞(HAECs)中精氨酸酶Ⅱ的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄
　　精氨酸酶Ⅱ的mRNA與蛋白表達可分別被PARP-1

8、小干擾RNA抑制80％及75％;同時應(yīng)用PARP-1過表達載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染到HAECs在過表達PARP-1的同時，可使精氨酸酶Ⅱ增加表達3倍左右。PARP-1作為轉(zhuǎn)錄因子參與精氨酸酶Ⅱ的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。
　　3.氧化低密度脂蛋白在體內(nèi)外均可上調(diào)多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1的表達oxLDL(50μg/ml)處理24h可使HAECs細胞中PARP-1蛋白表達較對照組提高4倍，PARP-1 mRNA水平的增高在oxLDL處理24h呈現(xiàn)劑

9、量依賴性，最大效應(yīng)出現(xiàn)在oxLDL50μg/ml組，與對照組相比增高約3.54倍。HAECs中PARP-1mRNA表達在50μg/ml的oxLDL刺激后0.5h即開始增加，并持續(xù)24h，表達最高水平在刺激后1小時出現(xiàn)，約為對照組的4倍。共聚焦顯微鏡觀察到高膽固醇飲食喂養(yǎng)的小鼠主動脈內(nèi)皮PARP-1表達較正常飲食的小鼠增高3倍以上。同時，發(fā)生粥樣硬化的動脈較正常人主動脈其PARP-1表達也明顯升高。oxLDL在體內(nèi)外均能刺激PARP-1的

10、生成。
　　4.多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1介導(dǎo)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的精氨酸酶Ⅱ表達并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能
　　高膽固醇飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠主動脈精氨酸酶Ⅱ的表達較正常飲食者明顯升高，但PARP-1-/-小鼠主動脈的精氨酸酶Ⅱ的表達低于野生型小鼠，且與正常飲食的野生型小鼠相比并無差異。高脂飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠主動脈eNOS表達較正常飲食者明顯降低，但高脂飲食下PARP-1-/-小鼠主動脈eNOS表達顯著高于野生型小鼠。正常飲食的野

11、生型小鼠主動脈NO的產(chǎn)生顯著高于高脂飲食飼養(yǎng)者，而PARP-1-/-小鼠主動脈NO的產(chǎn)生顯著高于同樣接受高脂飲食飼養(yǎng)的野生型小鼠。同樣飲食喂養(yǎng)情況下（正常或高膽固醇飲食），PARP-1-/-小鼠主動脈環(huán)血管舒張性都顯著高于野生型小鼠。PARP-1通過調(diào)節(jié)精氨酸酶Ⅱ的生成而介導(dǎo)oxLDL抑制eNOS/NO表達。
　　5.氧化低密度脂蛋白通過磷酸化的ERK2與PARP-1相互作用上調(diào)精氨酸酶Ⅱ的表達
　　PARP-1的表達在ox

12、LDL刺激時可顯著增加，而MEK1/2磷酸化的抑制劑PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制劑U0126均可抑制PARP-1的表達。在應(yīng)用抗PARP-1的抗體進行免疫沉淀所得的蛋白中可檢測到磷酸化的ERK2，而且oxLDL刺激組遠高于相應(yīng)的對照組。蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，MEK1/2磷酸化的抑制劑PD98059、ERK1/2磷酸化的抑制劑U0126以及PARP-1抑制劑DPQ處理均可顯著降低精氨酸酶Ⅱ的表達。
　　6.oxLDL增強

13、PARP-1與肌球蛋白Myosin相互作用并調(diào)控精氨酸酶Ⅱ的表達
　　質(zhì)譜分析與PARP-1相互作用的蛋白，并用免疫共沉淀證實檢測到Myosin可以與PARP-1相互作用。OxLDL刺激后HAECs肌球蛋白Myosin表達明顯增多，較對照組升高4.37倍。免疫組化顯示，PARP-1和肌球蛋白Myosin共定位于血管內(nèi)皮，且人動脈粥樣硬化的動脈比正常的動脈表達更多。小鼠體內(nèi)高膽固醇飲食也可誘使主動脈肌球蛋白Myosin表達明顯增多。

14、PARP-1敲除小鼠較野生型小鼠主動脈內(nèi)皮中肌球蛋白Myosin的表達明顯降低。
　　7.oxLDL通過PARP-1-myosin復(fù)合物介導(dǎo)染色質(zhì)重塑上調(diào)精氨酸酶Ⅱ表達
　　組蛋白2A經(jīng)氧化低密度脂蛋白刺激后乙酰化增強，而PARP-1小干擾RNA處理組可促使其脫乙?；9873，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑，可以抑制組蛋白2A的乙?；M而抑制精氨酸酶Ⅱ表達，顯著逆轉(zhuǎn)氧化低密度脂蛋白引起的精氨酸酶Ⅱ高表達。肌球蛋白myosin抑制

15、劑ML-7干預(yù)主動脈內(nèi)皮細胞，能逆轉(zhuǎn)由氧化低密度脂蛋白刺激誘導(dǎo)的乙?；M蛋白H2A的高表達。肌球蛋白myosin抑制劑也可逆轉(zhuǎn)由氧化低密度脂蛋白刺激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞精氨酸酶Ⅱ高表達。
　　結(jié)論：
　　1.PARP-1可作為轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于精氨酸酶Ⅱ啟動子區(qū)域。
　　2.抑制PARP-1可以降低內(nèi)皮源性的精氨酸酶Ⅱ表達，增加eNOS的活性及NO的生成。
　　3.oxLDL可以通過磷酸化的ERK2向核內(nèi)遷移并直接作