日本血吸蟲潛在藥物靶點β-碳酸酐酶的表達與鑒定.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患病，在我國廣泛分布于長江流域及其以南地區(qū)，曾嚴重影響我國社會經(jīng)濟發(fā)展，威脅人民健康，是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一，國家正著手制定血吸蟲防治新十年規(guī)劃。吡喹酮是目前治療血吸蟲病唯一一個安全高效的治療藥物，從上世紀70年代末開始使用到現(xiàn)在已有30多年歷史，近年來在非洲和南美洲的一些曼氏血吸蟲流行區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了對吡喹酮不敏感的地理株，甚至出現(xiàn)吡喹酮治療無效的異?，F(xiàn)象，尋找新的藥物靶標從而

2、研制出針對于血吸蟲病的新的治療藥物是目前的公共衛(wèi)生需求。β-碳酸酐酶(β-CAs)是自然界中廣泛分布的鋅金屬酶，能高效催化CO2的水合作用，其生理功能多樣，對諸多生物體的生命活動具有重要作用。β-CAs可被磺胺類藥物、氨基磺酸鹽及陰離子等藥物或化合物所抑制，且目前研究顯示β-CAs抑制劑對部分病原體有體內(nèi)抑制活性。由于β-CAs對生物體的重要作用，且不分布于脊椎動物，是一個極具吸引力的藥物作用靶點，前景廣闊，有望開發(fā)新機制的廣譜抗菌、抗

3、寄生蟲藥物。
　　本研究擬表達日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）的潛在藥物靶點β-CA，為抗血吸蟲新藥的篩選提供平臺。首先通過生物信息學(xué)的方法以保守序列比對獲得表達日本血吸蟲β-CA的cDNA序列Sjp_0056790.1，并將其在原核表達系統(tǒng)進行融合表達。SDS-PAGE及Western blotting初步鑒定表達蛋白后，采用Ni親和層析方法純化目的蛋白，重折疊復(fù)性之后進行碳酸酐酶活性測定，并進一步進行日

4、本血吸蟲的體外藥物抑制實驗，以驗證日本血吸蟲β-CA作為新機制的抗日本血吸蟲藥物靶點的可行性。
　　最終尋找到的可能編碼日本血吸蟲β-CA的氨基酸序列與現(xiàn)已知的多個β-CAs氨基酸序列在保守序列位置上一致;經(jīng)PCR和雙酶切驗證表明，重組表達載體pET-32a(+)-SjaCA構(gòu)建成功;SDS-PAGE和Western blotting檢測結(jié)果顯示融合蛋白分子量大小約為38kDa，與預(yù)期相符，可被抗His標簽抗體識別;碳酸酐酶活性測

5、定結(jié)果顯示該表達蛋白具有與標準品碳酸酐酶相似的催化CO2水合作用的活性，且該活性受碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺(AAZ)抑制。體外藥物抑制實驗結(jié)果表明，日本血吸蟲的體外培養(yǎng)可受AAZ抑制，抑制效果達到微摩爾級。
　　本研究通過生物信息學(xué)的方法鑒定了編碼日本血吸蟲β-CA的cDNA序列，并成功使用原核表達系統(tǒng)表達出具有催化CO2水合作用活性的日本血吸蟲β-CA，且該活性受碳酸酐酶抑制劑AAZ的抑制。此外，碳酸酐酶抑制劑AAZ對日本血吸蟲具