MicroRNa-214在骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中作用的研究.pdf

1、目的:骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是臨床最普遍、最常見的關節(jié)退行性疾病之一，常常受累于膝關節(jié)和髖關節(jié)，其中膝關節(jié)受累最常見。OA可能是由各種因素引發(fā)的全關節(jié)性疾病，其中關節(jié)軟骨和軟骨下骨的變化尤為明顯和重要，隨著其內部任何結構和調節(jié)的改變，都會影響全關節(jié)的內部平衡穩(wěn)態(tài)，從而導致疾病的發(fā)生。MicroRNAs（miRNAs，miR）已被發(fā)現(xiàn)在骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起到至關重要的作用。本研究探討不同分級的骨性關節(jié)炎患者膝關節(jié)

2、軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達、分子基因水平等特點，研究miR-214的表達在OA發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法:(1)收集從2013年10月-2014年12月的行人工全膝關節(jié)置換術后的原發(fā)性OA患者的脛骨平臺40例為實驗標本，觀察標本脛骨平臺大體觀，按照膝關節(jié)OA的Outerbridge分級標準進行肉眼分級后，檢測各組軟骨及軟骨下骨中miR-214的表達水平。(2)取3天齡健康C57乳鼠20只，提取膝關節(jié)軟骨細胞后，對其進

3、行IL-1β和antagomir-214的誘導培養(yǎng)，分別檢測代表軟骨細胞功能相關基因的表達情況及細胞外基質的分泌情況。(3)40只C57隨機分成實驗組(ACLT手術組和ACLT聯(lián)合antagomir-214組，每組10只)和對照組（假手術組和假手術聯(lián)合antagomir-214組，每組10只）。取膝關節(jié)標本進行大體觀察、組織學染色、免疫組化染色、實時熒光定量PCR等檢測。(4)2月齡新西蘭大白兔分離培養(yǎng)軟骨細胞，與去細胞軟骨基質支架制備

4、細胞-支架復合物。對照組單純細胞支架復合靜態(tài)培養(yǎng)1d，實驗組于Instron生物反應器中培養(yǎng)，加以力學刺激(力學加載參數(shù)為3h/d，1Hz，壓縮量為10％)7，14，21，28d。
　　結果:(1)檢測不同Outbridge級別OA樣本后，軟骨中，所有樣本均有miR-214表達，各組表達水平呈逐漸上升趨勢(P＜0.05)。軟骨下骨中，miR-214的表達水平在Ⅲ級組明顯高于Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅳ級組(P＜0.05)。(2)軟骨細胞經(jīng)不同誘

5、導培養(yǎng)后，IL-1β組染色顯示隨著IL-1β誘導時間的延長，基質染色陽性率逐漸降低。IL-1β+antagomir-214組基質陽性染色率遞增。免疫組化染色顯示IL-1β組隨著誘導時間的延長，COL-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13陽性顯色逐漸增加，COL-Ⅱ陽性顯色逐漸降低。IL-1β+antagomir-214組，COL-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13陽性染色逐漸降低。RT-PCR結果顯示IL-1β組COL-Ⅱ的表達水平逐漸降低;而COL

6、-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13的表達均逐漸升高，并且miR-214的表達也逐漸升高。IL-1β+antagomir-214組，COL-Ⅱ的表達水平逐漸升高;COL-Ⅰ、COL-Ⅹ、MMP-13的表達水平逐漸降低。(3)動物模型實驗結果影像學顯示OA模型小鼠膝關節(jié)呈骨關節(jié)炎表現(xiàn)。miR-214的表達水平隨OA模型建立的時間逐漸升高(P＜0.05)。而關節(jié)腔注射antagomir-214后，病變對比未注射antagomir-214，骨質增生

7、相對減少，關節(jié)退變程度較低。組織學染色顯示動物模型建立后，軟骨細胞逐漸增生肥大，細胞外基質染色逐漸減少。而ACLT+antagomir-214組中軟骨退變較ACLT組減少，細胞外基質保留較多。免疫組化結果對照組軟骨基質中Ⅱ型膠原陽性著色均勻，而ACLT組軟骨基質中Ⅱ型膠原陽性著色逐漸減少，基質丟失較多。ACLT+antagomir-214組中Ⅱ型膠原陽性染色相對較高，基質丟失較少。(4)隨著培養(yǎng)時間的延長，實驗組細胞-支架復合物彈性模量

8、顯著高于對照組(P＜0.05)。實驗組切片番紅“O”染色見細胞-支架復合物的細胞外基質中有大量蛋白聚糖形成，隨力學刺激時間延長而逐漸增加。RT-PCR檢測示，實驗組Ⅰ，Ⅱ型膠原表達均高于對照組(P＜0.05)，實驗組中力學刺激21d時Ⅱ型膠原表達最高(P＜0.05);Ⅰ型膠原在力學刺激28d表達最高(P＜0.05)。隨著力學刺激時間延長，miR-214表達在加載21天后逐漸升高。
　　結論:(1)miR-214的表達水平與骨性關節(jié)