藏花酸對CYP3A4、1A2酶活性的影響研究.pdf

1、藏花酸(Crocetin)又名番紅花酸或西紅花酸,為磚紅色正交結晶,具有多不飽和共軛烯酸結構,來源于茜草科植物梔子果實,屬類胡蘿卜素物質,是藏紅花的主要有效成分之一。其藥理作用主要涉及呼吸、神經、心血管及泌尿系統(tǒng)等各方面。本課題組前期研究表明Crocetin主要經CYP3A4、1A2酶代謝。但Crocetin是否對CYP450酶活性存在影響及與其他藥物合用是否會產生相互作用等并未進行過深入探討。因此本課題首先通過大鼠及人肝微粒體孵育體系

2、在體外水平研究Crocetin對CYP3A4、1A2酶的影響,然后再結合大鼠體內實驗,進一步考察Crocetin對CYP3A酶活性的影響,以期為Crocetin在臨床的合理應用提供相應的理論依據。
　　目的:
　　本實驗首先通過體外人、大鼠肝微粒體模型研究Crocetin對主要代謝酶CYP3A4、1A2酶活性的影響,再結合大鼠體內實驗,進一步考察Crocetin對CYP3A酶活性的影響,為Crocetin的研究提供更多理論依

3、據。
　　方法:
　　1.建立檢測大鼠肝微粒體中咪達唑侖(MDZ)、非那西丁(PHE)及人肝微粒體中MDZ、PHE的HPLC方法;
　　2.建立檢測大鼠血漿中MDZ的HPLC方法;
　　3.在體外大鼠、人肝微粒體溫孵體系中建立MDZ和PHE各自的最佳溫孵時間、最佳蛋白濃度及最適底物濃度;
　　4.通過體外大鼠、人肝微粒體模型,研究各劑量Crocetin對大鼠、人肝微粒體CYP3A4、CYP1A2亞酶活性的影

4、響;
　　5.通過大鼠體內實驗,考察單次腹腔注射不同劑量Crocetin,尾靜脈注射相同劑量的MDZ后,Crocetin對CYP3A介導的MDZ藥代動力學的影響。
　　結果:
　　1.建立了檢測大鼠肝微粒體中MDZ、PHE及人肝微粒體中MDZ、PHE的HPLC方法;
　　2.建立了檢測大鼠血漿中MDZ的HPLC方法;
　　3.在大鼠肝微粒體實驗中,MDZ在37℃,120r/min的條件下進行孵育,在1-40

5、min內,MDZ的消除量隨時間的增加而明顯增加,故選擇的最佳孵育時間為40min;當蛋白濃度在0.05-0.3mg/ml范圍內時,蛋白濃度越大,MDZ的消除量就越大,因此確定最佳蛋白濃度為0.3mg/ml;當底物在2.5-10μM濃度范圍內時,MDZ代謝量隨底物濃度的升高而增加,當底物濃度超過10μM時,MDZ代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此,確定的最佳底物濃度為10μM。PHE在37℃,120r/min的條件下進行孵育,5-40

6、min內,PHE呈線性消除,當超過40min時,PHE消除量很少變化,所以我們選擇的最佳孵育時間為40min;在0.1-0.4mg/ml范圍內,蛋白濃度越大,PHE的消除量就越多,故確定最佳蛋白濃度為0.4mg/ml;而當底物在5-80μM濃度范圍內時,PHE代謝量隨底物濃度的升高而增加,當底物濃度超過80μM時,PHE代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此選擇的最適底物濃度為80μM;
　　4.在體外大鼠肝微粒體實驗中,Croc

7、etin在濃度為0.5-80μM時對CYP3A的酶活性影響均有顯著性差異(P＜0.05)。MDZ在Crocetin濃度為0.5-80μM時代謝量的均數分別降低了15.55％、35.27％、48.77％、59.74％、61.72％、67.88％、71.11％(P＜0.05)。Crocetin在濃度為0.5-80μM時對CYP1A2的酶活性影響同樣均有顯著性差異(P＜0.05)。PHE在Crocetin濃度為0.5-80μM時代謝量的均數分

8、別降低了10.17％、21.38％、33.43％、52.09％、63.01％、77.32％、81.24％(P＜0.05)。且Crocetin對CYP3A、CYP1A2抑制50％酶活性的IC50分別為6.814μM、9.157μM;
　　5.在人肝微粒體實驗中,MDZ在37℃,120r/min的條件下進行孵育,在1-30min內,MDZ的消除量隨時間的增加而明顯增加,當超過30min時,MDZ的消除量不再隨時間的增加而增加,故選擇的

9、最佳孵育時間為30min;當蛋白濃度在0.05-0.2mg/ml范圍內時,MDZ呈線性消除,因此確定最佳蛋白濃度為0.2mg/ml;當底物在2.5-10μM濃度范圍內時,MDZ代謝量隨底物濃度的升高而增加,當底物濃度超過10μM時,MDZ代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此,確定的最佳底物濃度為10μM。PHE在37℃,120r/min的條件下進行孵育,5-40min內,PHE的消除量隨時間的增加而增加,當超過40min時,PHE消除

10、量很少變化,所以我們選擇的最佳孵育時間為40min;在0.1-0.4mg/ml范圍內,PHE呈線性消除,故確定最佳蛋白濃度為0.4mg/ml;而當底物在5-80μM濃度范圍內時,PHE代謝量隨底物濃度的升高而增加,當底物濃度超過80μM時,PHE代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此選擇的最適底物濃度為80μM;
　　6.在體外人肝微粒體中,Crocetin在濃度為0.5-80μM時對CYP3A4的酶活性影響均有顯著性差異(P＜0

11、.01)。MDZ在Crocetin濃度為0.5-80μM時代謝量的均數分別降低了25.36％、32.37％、38.91％、45.96％、51.74％、59.24％、67.72％(P＜0.01)。Crocetin在濃度為0.5-80μM時對CYP1A2的酶活性影響同樣均有顯著性差異(P＜0.05)。PHE在Crocetin濃度為0.5-80μM時代謝量的均數分別降低了13.48％、30.55％、33.72％、42.67％、48.01％、5

12、6.62％、67.43％(P＜0.01)。且Crocetin對CYP3A4、CYP1A2抑制50％酶活性的IC50分別為13.271μM、19.225μM;
　　7.四組MDZ主要藥動學參數:空白組AUC(0-t)(361.209mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(403.953mg·L·min-1)、MRT(0-t)(37.78 min)、MRT(0-∞)(62.362min)、t1/2z(42.193 min)、CLz(

13、0.07 L·min-1·kg-1)、Vz(1.135 L·kg-1);低劑量組AUC(0-t)(454.895mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(499.209mg·L· min-1)、MRT(0-t)(49.004 min)、MRT(0-∞)(75.421 min)、t1/2z(52.806 min)、CLz(0.024 L·min-1·kg-1)、Vz(0.785 L·kg-1);中齊劑量組AUC(0-t)(636.417m

14、g·L·min-1)、AUC(0-∞)(704.421 mg·L·min-1)、MRT(0-t)(57.212 min)、MRT(0-∞)(92.241 min)、t1/2z(64.404 min)、CLz(0.017L· min-1· kg-1)、Vz(0.553 L·kg-1);高劑量組 AUC(0-t)(1050.388mg·L·min-11)、AUC(0-∞)(1177.015mg·L·min-1)、MRT(0-t)(64.68

15、1 min)、MRT(0-∞)(107.915 min)、t1/2zz(77.145 min)、CLz(0.006L·min-1·kg-1)、Vz(0.316L·kg-1)。結果表明給藥組MDZ的藥-時曲線下面積明顯比對照組高,提示Crocetin對MDZ的血藥濃度存在明顯影響,且該影響隨Crocetin濃度的增高而加強。
　　結論:
　　1.建立的大鼠肝微粒體中MDZ、PHE及人肝微粒體中MDZ、PHE的HPLC檢測方法靈

16、敏可靠;
　　2.建立的大鼠血漿中MDZ的HPLC檢測方法靈敏可靠;
　　3.在大鼠肝微粒體中,Crocetin對CYP1A2、CYP3A亞酶活性呈中等程度抑制作用;
　　4.在人肝微粒體中,Crocetin對CYP1A2、CYP3A4亞酶活性則呈現較弱的抑制作用;
　　5.在大鼠體內,給藥組MDZ的藥-時曲線下面積明顯比對照組高,提示Crocetin對MDZ的血藥濃度存在明顯影響,且該影響隨Crocetin濃度