CD44在卵巢癌-骨肉瘤進展中的作用及上轉換納米逆轉腫瘤耐藥的研究.pdf

1、背景：癌癥是嚴重危害公眾健康的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率一直在攀升，已成為疾病死因之首。一些高表達的細胞表面分子參與了癌癥的發(fā)生，發(fā)展，并預示著不良臨床結局。在這些細胞分子中，分化抗原簇44（Cluster of Differentiation44，CD44）是一種由外顯子選擇性剪切而形成的蛋白家族。CD44跨膜糖蛋白家族介導了各種細胞生物學過程，包括生長，生存，分化及運動的調控。CD44是透明質酸的天然受體，也可以與其他配體結合，如骨

2、橋蛋白，膠原和基質金屬蛋白酶等等。CD44與HER2，Src激酶和ERK等配體的結合，可以直接激發(fā)不同信號通路之間的交叉反應。卵巢癌的死亡率在女性惡性腫瘤中位居第五，而且是致死率最高的女性生殖腫瘤。但是在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的卵巢癌治療方案，即手術切除病灶聯合化療藥物并沒有明顯改善卵巢癌患者的總體生存期。目前，我們對卵巢癌發(fā)生進展的具體機制還了解甚少。CD44的表達上調加強了腫瘤干細胞的分化，腫瘤細胞的增殖，耐藥產生和轉移。但是，CD4

3、4的表達在卵巢癌中的臨床意義仍然存有爭議。目前，還鮮有CD44的表達水平與卵巢癌患者的長期隨訪相關的研究。也尚未發(fā)現已報道的CD44與卵巢癌的相關研究中，將患者原發(fā)病灶，轉移病灶及復發(fā)病灶聯合分析。：骨肉瘤是一種主要累及骨骼的肉瘤。盡管近年來手術治療聯合多種藥物化療方案治療骨肉瘤取得了一定進展，但迄今為止，介導骨肉瘤惡性進展事件的細胞分子機制尚不清楚，包括轉移病灶的形成，耐藥現象的產生等等。已發(fā)表的CD44與骨肉瘤相關研究結果顯示CD4

4、4敲除小鼠骨肉瘤動物模型中骨肉瘤轉移受到抑制。但是，基于大量的骨肉瘤臨床組織標本和完善的臨床信息，關于CD44臨床關聯性的研究，還尚未見報道。微小RNA（microRNA，miR）可以結合靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)，參與調控腫瘤細胞的眾多生物學功能。是否有特異性的microRNA通過調控CD44而參與骨肉瘤的發(fā)生進展有待進一步研究。探究惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制是我們在攻克腫瘤道路上非常重要的環(huán)節(jié)，而研發(fā)新型腫瘤治療策略也不容忽視。因此

5、，研發(fā)新型腫瘤多藥耐藥逆轉策略，已經成為腫瘤治療過程中的關鍵。腫瘤多藥耐藥的發(fā)生涉及復雜的分子機制，其中最為經典的機制是P-糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）的高表達，Pgp屬于ATP依賴的跨膜蛋白轉運體家族的成員，是多藥耐藥基因1（Multidrug resistance1，MDR1）的蛋白產物。Pgp可將一些化療藥物通過主動轉運作用外排細胞，細胞內有效的藥物濃度不足，導致腫瘤細胞對化療藥物產生抵抗。因此，Pgp是逆轉腫瘤

6、多藥耐藥最有潛力的靶點之一。隨著1998年基因沉默的發(fā)現，小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）為提高耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性提供了新途徑?；騻鬟f過程中，有效的追蹤和定位，對于我們了解被攜帶基因在胞漿內的命運非常重要。納米技術的快速發(fā)展為基因傳遞和追蹤提供了廣闊的平臺。目前，大多數納米給藥系統(tǒng)的追蹤定位采用紫外線或短波長可見光作為激發(fā)光源，但是由于激發(fā)光的光毒性和較差的組織穿透性，限制了這些納米

7、系統(tǒng)的臨床應用。然而，上轉換納米材料（Upconversion nanoparticle，UCNP）可使用近紅外光作為激發(fā)光源，并將其轉換為肉眼可見的發(fā)射光。因此，上轉換納米應用于基因傳遞和追蹤將具有眾多優(yōu)勢，包括無光損傷，無自熒光，無熒光淬滅和較深的組織穿透深度。盡管一些研究已經表明上轉換納米可以用于基因的傳遞和追蹤，但是，尚未發(fā)現應用上轉換納米治療腫瘤耐藥同時追蹤定位攜帶基因的相關研究報道。
　　目的：評估CD44表達在卵巢癌

8、中的臨床意義，然后進一步研究CD44在卵巢癌進展中的生物學功能。
　　方法：①免疫組織化學染色法檢測人類卵巢癌組織芯片中CD44的表達水平。納入本研究的研究對象是在美國哈佛醫(yī)學院麻省總醫(yī)院接受治療的26例卵巢癌患者，其中每例患者均有原發(fā)期，轉移期和復發(fā)期的腫瘤組織標本。②建立人卵巢癌細胞的裸小鼠移植瘤模型，蛋白印跡法（Western blot）檢測腫瘤復發(fā)的過程中，腫瘤組織CD44蛋白表達水平的變化。③Western blot和細

9、胞免疫熒光法檢測細胞的CD44蛋白表達水平。④MTT法和3D細胞培養(yǎng)法分別檢測細胞的增殖能力和細胞球體形成能力。⑤MTT法檢測細胞對化療藥物紫杉醇的敏感性。⑥采用劃痕修復實驗和基質膠侵襲實驗，分別檢測細胞的遷移和侵襲潛能。⑦采用GraphPad Prism5軟件進行數據的統(tǒng)計分析，所有數據表示為均數±標準差。兩組數據間的比較方法為雙側Student’s t-test或Mann-Whitney’s檢驗。無病生存期分析和總生存期分析方法為

10、Kaplan-Meier survival curves和Gehan-Breslow-Wilcoxon test。以α=0.05作為檢驗水準。
　　結果：⑴免疫組織化學染色人類卵巢癌組織芯片的結果表明，原發(fā)，轉移和復發(fā)卵巢癌組織CD44表達相對評分分別為1.43，2.06和2.04。其中轉移組與原發(fā)組比較P<0.05，復發(fā)組與原發(fā)組比較P<0.05。⑵生存分析結果顯示，高蛋白表達水平的CD44與卵巢癌患者總生存率關聯性P<0.05

11、，CD44與無病生存率關聯性P<0.05。⑶SKOV-3／SKOV-3TR和OVCAR8／OVCAR8TR均表達一定蛋白水平的CD44，然而，耐藥細胞 SKOV-3TR和OVCAR8TR均比其對應的敏感細胞SKOV-3和OVCAR8表達較高蛋白水平的CD44（P<0.05）。⑷生理鹽水組與10 mg/kg紫杉醇組腫瘤組織中CD44蛋白表達水平比較沒有統(tǒng)計學差異（P>0.05）。然而，20 mg/kg和25 mg/kg紫杉醇治療組腫瘤組織

12、中CD44表達水平與生理鹽水組比較均有顯著升高（P<0.05）。⑸成功建立OVCAR8Lentivirus only（空慢病毒載體轉導）），OVCAR8Non-specific shRNA（攜帶非特異性shRNA慢病毒載體轉導）和OVCAR8CD44 shRNA（攜帶CD44 shRNA慢病毒載體轉導）三種細胞系，OVCAR8CD44 shRNA細胞中CD44蛋白表達被穩(wěn)定抑制。⑹與空白對照組OVCAR8比較，OVCAR8Lentivi

13、rus only和OVCAR8Non-specific shRNA的增殖狀況均無明顯差異（P>0.05），而OVCAR8CD44 shRNA細胞的生長被顯著抑制（P<0.05）。⑺OVCAR8CD44 shRNA細胞形成的細胞球體直徑比其他三種組細胞OVCAR8，OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific shRNA要?。≒<0.05）。⑻OVCAR8CD44 shRNA細胞幾乎不能夠耐受0.006

14、μM的紫杉醇，而在同樣給藥濃度下，OVCAR8，OVCAR8Lentivirus only和OVCAR8Non-specific shRNA細胞仍能夠較好地生長。⑼經過24 h遷移后，空白對照組和非特異性siRNA轉染組中的細胞劃痕幾乎被修復。而CD44 esiRNA轉染組的細胞劃痕修復能力明顯受到抑制（P<0.05）。⑽CD44 esiRNA轉染組的細胞穿過基質膠的數目明顯少于空白對照組和非特異性siRNA轉染組（P<0.05）。