HIF-1a誘導胰腺癌細胞去分化及轉(zhuǎn)移作用及其靶向成像研究.pdf

1、胰腺癌（Pancreatic cancer）在腫瘤導致死亡中位居第四位，具有進展迅速、轉(zhuǎn)移早、放化療抵制等特點。目前，胰腺癌基礎(chǔ)及臨床相關(guān)研究雖然獲得了一些進展，但五年生存率仍維持在5％左右。針對胰腺癌的有效診療手段仍然任重而道遠。探索胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程及其確切機制，仍然是當前胰腺癌基礎(chǔ)及臨床研究的重點、難點。研究表明：應激（缺氧、乏養(yǎng)、放化療）誘導的腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。病理研究顯示：作為一種乏血供腫瘤組織

2、，胰腺癌組織中存在大面積的低氧乏氧區(qū)。近年來，低氧誘導因子-1（Hyopxia induced factor-1）在實體瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用引起了越來越多的關(guān)注。針對胰腺癌的大規(guī)模臨床標本檢測發(fā)現(xiàn)：HIF-1a表達水平與胰腺癌預后呈高度負相關(guān)，是誘導腫瘤增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸的關(guān)鍵分子。然而，其確切機制尚未完全闡明。
　　本研究目的：
　　(1)明確低氧條件下，HIF-1a誘導自噬在胰腺癌非干細胞去分化中的作用及

3、其確切機制；
　　(2)明確低氧條件下，HIF-1a誘導自噬在胰腺癌干細胞轉(zhuǎn)移中的作用及其確切機制；
　　(3)篩選能與HIF-1a特異性配對結(jié)合的DNA寡核苷酸短鏈，合成多功能納米粒子，初步探討其應用于胰腺癌干細胞體內(nèi)外磁共振靶向成像效果。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　(1)采用改良的Transwell分離實驗方法，篩選人胰腺癌細胞系（Panc-1）中胰腺癌干細胞以及胰腺癌非干細胞；并利用流式細胞儀、成球?qū)嶒?、?/p>

4、疫熒光、Western Blot及體內(nèi)致瘤實驗檢測分選出的胰腺癌細胞的干性；
　　(2)將分選出的胰腺癌非干細胞培養(yǎng)在間歇性低氧條件下（1%氧氣、94%氮氣環(huán)境中培養(yǎng)12 h后，再在20%氧氣培養(yǎng)12 h，如此反復4次），利用干擾和沉默技術(shù)，給予以下分組：
　?、賹φ战M；
　?、谝认侔┓歉杉毎?HIF-1a siRNA；
　?、垡认侔┓歉杉毎?3-MA（自噬抑制劑）；
　?、芤认侔┓歉杉毎?HIF-1a s

5、iRNA+3-MA。在以下時間點（24h，48h，72h），采用顯微鏡觀測細胞成球能力及形態(tài)，流式細胞技術(shù)檢測細胞內(nèi)CD133+細胞比例，RT-PCR及Western-blot分析細胞相關(guān)基因及蛋白表達水平變化（Oct-4、c-MYC、CD44、HIF-1a、LC3-I、LC3-II、Beclin1）。
　　(3)將分選的胰腺癌干細胞培養(yǎng)在間歇性低氧條件下（1%氧氣、94%氮氣環(huán)境中培養(yǎng)12 h后，再在20%氧氣培養(yǎng)12 h，如此

6、反復4次），利用干擾和沉默技術(shù)，給予以下分組：
　?、賹φ战M；
　　②胰腺癌干細胞+HIF-1a siRNA；
　　③胰腺癌干細胞+3-MA（自噬抑制劑）；
　?、芤认侔└杉毎?HIF-1a siRNA+3-MA。作用不同時間（24h，48h，72h）點，觀察以下指標：Tranwell觀察細胞轉(zhuǎn)移情況；Western-blot檢測細胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達含量變化（HIF-1a、CD133、CD44、E-Ca、Veme

7、ntin、MMP-9、LC3-II、Beclin1）。
　　(4)γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈納米顆粒合成和制備；分析其穩(wěn)定性及毒性。
　　(5)胰腺癌干細胞、胰腺癌非干細胞與γ-Fe3O4@DMSA-DNA寡核苷酸短鏈納米顆粒共浴，MTT及流式技術(shù)檢測納米粒子對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響；普魯士藍染色及3.0T磁共振觀察納米粒子與胰腺癌干細胞、胰腺癌非干細胞結(jié)合的特異性及體外成像靶向性。
　　(6)構(gòu)建

8、胰腺癌裸鼠皮下瘤模型，尾靜脈注射γ-Fe3O4@DMSA及γ-Fe3O4@DMSA- DNA納米顆粒，注射后30min、1.5h、2h、24h等不同時間點，采用3.0T磁共振觀察瘤體信號改變，測量T2弛豫時間。
　　研究結(jié)果：
　　(1)改良的Transwell分離實驗可以作為分選腫瘤干細胞實驗手段之一，且該方法具有簡單易行、經(jīng)濟、可重復性強等特點。
　　(2)間歇性缺氧條件下，HIF-1a可以通過誘導自噬，促進胰腺癌

9、非干細胞去分化而獲得干細胞的表型和功能。
　　(3)作為缺氧誘導的核心分子之一，HIF-1a在缺氧應激條件下是促進胰腺癌干細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控分子，而其主要通過誘導胰腺癌干細胞EMT轉(zhuǎn)化及自噬來實現(xiàn)這一過程。
　　(4)與HIF配對的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子可以特異性結(jié)合到胰腺癌干細胞，并且隨著時間的延長，結(jié)合效率逐漸增高。胰腺癌非干細胞可以結(jié)合少量的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子，但即使共育時間延長，結(jié)

10、合效率也無明顯增高。同時胰腺癌干細胞結(jié)合納米磁粒子的時間明顯要早于胰腺癌非干細胞，這一時間梯度差，為臨床MRI檢測胰腺癌干細胞增加了可行性。
　　(5)裸鼠皮下胰腺癌模型中，能特異結(jié)合HIF-1a的DNA寡核苷酸短鏈偶聯(lián)氧化鐵納米磁粒子能在瘤體內(nèi)聚集，其與單純氧化鐵納米粒子在注射30min、1.5h、2h及24h后瘤體的T2弛豫時間有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：
　　(1)在缺氧應激條件下，HIF-1a通過自噬維持胰腺癌干