紫外線對皮膚角質形成細胞DNA的損傷效應及白藜蘆醇保護作用的研究.pdf

1、日光中的紫外輻射依據生物學作用不同可以分為波長為320～400nm的長波紫外線(UVA)、波長為280～320nm的中波紫外線(UVB)和波長為200～280nm的短波紫外線(UVC)。臭氧層位于距地表十幾公里以上的對流層，它像一塊毯子覆蓋在地球上空，可以阻擋100％的UVC和絕大部分的UVA、UVB到達地面，是地球上生物生命活動的天然屏障。自1974年科學家發(fā)現(xiàn)臭氧層遭破壞以來，到目前為止南極和北極都己出現(xiàn)了臭氧空洞。而由于臭氧層的破

2、壞，到達地面的紫外輻射也隨之增多。表皮是位于人體最外層的天然屏障，是與外界直接接觸的器官，保護著機體免受外界不良環(huán)境的侵害。紫外輻射是皮膚接觸的重要的物理因素之一。過量的紫外輻射可以引起炎癥，紅斑，免疫抑制甚至皮膚癌。早在1997年日本大阪大學醫(yī)學系就通過實驗證實，紫外線能致皮膚癌，在過去的幾十年里，歐美地區(qū)皮膚癌的發(fā)生率也顯著增加，據統(tǒng)計，每減少1％臭氧含量，皮膚癌的發(fā)病率將會增加2％～3％。
　　研究發(fā)現(xiàn)皮膚癌是紫外線導致的D

3、NA損傷和基因突變累積的結果。DNA是最重要的遺傳物質，DNA受損將會影響細胞的生長、發(fā)育和增殖，是造成突變、癌變和死亡的重要原因。不同波段的UV對DNA的損傷方式不同，如UVA主要引起間接損傷，UVB、UVC處于紫外線吸收峰附近，可被DNA吸收造成直接損傷，另外UVB也可因產生過量的ROS造成DNA間接損傷。HaCaT細胞（人永生化角質形成細胞），是研究紫外輻射皮膚損傷的理想模型。因此本實驗選取HaCaT細胞為研究對象，研究了不同紫外

4、波段對DNA的損傷效應。
　　針對由輻射引起的DNA損傷的防護，除了紫外織物、物理阻斷劑和化學吸收劑之外，抗氧化劑一直是研究的熱點。但是現(xiàn)有抗氧化劑會有不穩(wěn)定等缺點，尚不夠理想，且每一種抗氧化劑并不能完全消除紫外線的損傷。因此尋找新的抗氧化劑是重要的舉措。白藜蘆醇(resveratrol; RSV)是一種天然酚類化合物，不僅具有抗炎、抗腫瘤、心血管保護和神經保護的作用，而且是一種重要的抗氧化劑。因此本實驗從DNA損傷角度檢測了白藜

5、蘆醇對紫外線誘導的HaCaT細胞DNA損傷的防護作用并對其保護機制做了初步探索。
　　目的：
　　研究不同劑量和不同波段紫外線對HaCaT細胞DNA的損傷效應和白藜蘆醇對紫外線致HaCaT細胞DNA損傷的保護作用及其機制。
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)
　　HaCaT細胞接種于60mm×15mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基含體積分數(shù)為10％的小牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、單位為1×105U/

6、L青霉素、質量濃度為100mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、體積分數(shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)貼壁培養(yǎng)。
　　2、紫外線照射
　　培養(yǎng)皿中細胞長至80％～90％融合時棄培養(yǎng)基，用1mlPBS漂洗2遍后加入適量PBS覆蓋細胞，放在距光源垂直距離為40cm位置進行紫外線照射。
　　3、彗星電泳檢測紫外輻射誘導的DNA損傷
　　選用不同波段UV(UVA、UVB、UVC)為照射源，以不同劑量(0、10、30、

7、50、70、90mJ/cm2)照射HaCaT細胞后，收集細胞，制成細胞懸液。在堿性裂解液中裂解后解旋，電泳，中和，染色，漂洗。拍照之后進行CASP軟件分析。
　　4、彗星電泳檢測白藜蘆醇對紫外輻射誘導的DNA損傷的保護作用
　　HaCaT細胞于UVB或UVC照射前加入不同濃度白藜蘆醇（使用終濃度0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）培養(yǎng)12小時，棄去含有白藜蘆醇的培養(yǎng)基，1ml PBS漂洗2遍后照射方法同前。

8、選用UVB、UVC為照射光源，照射劑量為30mJ/cm2。照后收集細胞制成細胞懸液。在堿性裂解液中裂解后解旋，電泳，中和，染色，漂洗。拍照之后進行CASP軟件分析。
　　5、彗星電泳檢測白藜蘆醇和SIRT抑制劑預處理對紫外輻射誘導的DNA損傷作用的影響
　　HaCaT細胞于UVB照射前加入25μmol/L白藜蘆醇、5mmol/L SIRT抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)16小時，棄去含舊培養(yǎng)基，1mlPBS漂洗2遍后照射方法同前。選用UVB為

9、照射光源，照射劑量為30mJ/cm2。照后收集細胞進行彗星電泳。
　　6、Western blot(WB)檢測不同劑量UVB照射后SIRT6基因的表達變化
　　不同劑量的UVB照射后立即收集細胞，具體方法是棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，提取細胞總蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉、一抗室溫孵育1h后4度孵育過夜、TBST漂洗3次、二抗室溫孵育2h、TBST漂洗3次后進行化學發(fā)光反應，并顯影。
　　7、彗星電泳檢測細胞

10、轉染siSIRT6后對紫外輻射致DNA損傷的影響
　　細胞轉染后24小時，選用UVB為照射光源，照射劑量為30mJ/cm2，照射方法同前;照射后立即收取細胞進行彗星電泳。
　　8、qPCR和Western blot檢測SIRT6基因mRNA水平表達變化
　　白藜蘆醇和SIRT抑制劑預處理后，用30mJ/cm2UVB照射HaCaT細胞后立即收集細胞，同時提取蛋白和RNA。Trizol法提取細胞的總RNA，并通過反轉錄PC

11、R反轉錄成cDNA，用瓊脂糖水平電泳觀測測后，qPCR檢測SIRT6mRNA水平表達情況的改變。細胞收取后，提取細胞總蛋白定量，Western blot具體方法同上。
　　9、統(tǒng)計學分析
　　采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，以(x)±s描述，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析;多重比較，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Dunnett-T3法，檢驗水準α=0.05。

12、　　結果：
　　1、0～90mJ/cm2范圍內，未見UVA對HaCaT細胞DNA分子的損傷。選用UVB、UVC為照射光源進行不同劑量照射時，兩組均呈現(xiàn)隨照射劑量增加，彗尾加長，尾部熒光加強。TailDNA％、TailLength、CometLength、TailMoment、OliveTailMoment五個特異指標表征，UVB、UVC照射HaCaT細胞后，從最小劑量10mJ/cm2開始，實驗組五項指標均大于對照組，差異具有統(tǒng)計學

13、意義，且各個檢測參數(shù)隨照射劑量增加表現(xiàn)出劑量依賴效應。UVB和UVC兩照射組相比，相同劑量照射時，UVC組彗尾更長，尾部熒光更強，各指標值均大于UVB照射組。
　　2、單用白藜蘆醇處理正常HaCaT細胞，不會引起明顯的DNA損傷，即使用10μmol/L的白藜蘆醇處理HaCaT細胞12h，進行彗星電泳檢測，實驗組各個指標與對照組相比無顯著性差異。
　　3、白藜蘆醇預處理后再進行30mJ/cm2的UVB照射，彗星結果顯示相對于對

14、照組，UVB照射后HaCaT細胞DNA出現(xiàn)拖尾，尾部熒光加強;當加入不同濃度白藜蘆醇預處理后再進行UVB照射，其彗尾減小，尾部熒光減弱，與單獨UVB照射組相比， TailDNA％、TailLength、ComeLength、TailMoment、OliveTailMoment五個指標均呈現(xiàn)下降趨勢，且0.1μmol/L白藜蘆醇處理組與UVB組差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　4、白藜蘆醇預處理后再進行30mJ/cm2的UVC照射，結果顯

15、示相對于單獨照射組，其彗尾減小，尾部熒光減弱。與單獨照射組相比，白藜蘆醇處理后各個指標均呈下降趨勢，且在用0.1μmol/L或10μmol/L白藜蘆醇處理后與UVC組相比各指標差異均具有統(tǒng)計學意義;當用1μmol/L白藜蘆醇預處理后與UVC組相比TailDNA％、CometLength指標差異具有統(tǒng)計學意義。
　　5、當用30mJ/cm2UVB照射HaCaT細胞時，出現(xiàn)拖尾，尾部熒光變強;用25μmol/L白藜蘆醇預處理后再用UV

16、B照射則較UVB組拖尾減小，尾部熒光減弱;當加入5mM SIRT抑制劑后再照射UVB時，彗星拖尾較之于單獨UVB照射組，拖尾明顯加長，尾部熒光加強，TailDNA％、TailLength、CometLength、TailMoment、OliveTailMoment五個特異指標表征均增大。
　　6、Western blot檢測顯示不同劑量UVB照射后，SIRT6表達升高，且呈現(xiàn)量效關系。
　　7、彗星電泳顯示siSIRT6+U

17、VB組較siNC+UVB組，彗尾加長，尾部熒光加強;五個特異指標明顯增大，提示損傷加重。
　　8、qPCR和western blot檢測白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇+UVB組中SIRT6基因的應激反應表達情況，結果看出UVB照射引起SIRT6應激性升高;用不同濃度白藜蘆醇處理后SIRT6的表達水平也升高，且不同濃度白藜蘆醇處理后再用UVB照射SIRT6基因應激性升高更加明顯。
　　結論：
　　1、在研究范圍內，以彗星電泳為