LncRNA指紋譜作為胃癌標(biāo)志物及PHF10抑制胃上皮細(xì)胞分化致胃癌發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)LncRNA指紋譜作為胃癌標(biāo)志物及PHF10抑制胃上皮細(xì)胞分化致胃癌發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分;
　　第一部分：LncRNA指紋譜作為胃癌標(biāo)志物的研究。
　　目的：胃癌是一類惡性程度高、預(yù)后差的疾病。尋找新型診斷及預(yù)后標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷及治療均具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNAs）是一類已被證實(shí)在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中均發(fā)揮重要作用的RNA分子，因此可以作為胃癌的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究旨在尋

2、找與胃癌診斷及預(yù)后密切相關(guān)的lncRNAs。
　　方法：從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載4個(gè)胃癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，然后采用不同分類器和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分析等數(shù)據(jù)挖掘方法篩選得到對(duì)胃癌具有診斷及預(yù)后價(jià)值的lncRNAs，并通過(guò)qRT-PCR在胃癌組織樣本中對(duì)數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘，我們最終篩選得到一個(gè)由5個(gè)lncRNAs組成的lncRNA指紋譜（AK001094，AK024171，AK093735，BC003519和 NR_00

3、3573），該 lncRNA指紋譜對(duì)胃癌診斷及預(yù)后判斷均具有較高價(jià)值。Kaplan-Meier生存曲線及 Log-rank檢驗(yàn)顯示，基于這5個(gè) lncRNAs的患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者總生存時(shí)間顯著負(fù)相關(guān)（P=0.0001）。進(jìn)一步研究表明，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。對(duì)30對(duì)胃癌組織的qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)了這5個(gè)lncRNAs在胃癌中的確存在顯著表達(dá)失調(diào)；將該lncRNA指紋譜作為胃癌診斷的標(biāo)志物其AUC值可達(dá)到0.95±0.

4、025。GSEA分析揭示了多個(gè)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路與這5個(gè)lncRNAs密切相關(guān)。
　　結(jié)論：由這5個(gè)lncRNAs組成的lncRNA指紋譜對(duì)胃癌診斷及預(yù)后評(píng)估均具有較高的價(jià)值。
　　第二部分：PHF10抑制胃上皮細(xì)胞分化致胃癌發(fā)生的機(jī)制研究。
　　目的：分化障礙是惡性腫瘤的一個(gè)顯著特征。胃癌作為一類分化障礙性疾病，其分化障礙發(fā)生的機(jī)制目前尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子PHF10與胃癌組織學(xué)分化程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，提

5、示其可能參與胃癌分化障礙過(guò)程。為此，本研究旨在研究PHF10在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)模式、臨床意義及其對(duì)胃癌分化調(diào)控作用的分子機(jī)制。
　　方法：采用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、免疫組化(IHC)檢測(cè)正常胃粘膜至胃癌轉(zhuǎn)化的不同階段中PHF10表達(dá)模式、胃癌組織中PHF10表達(dá)水平并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。構(gòu)建PHF10過(guò)表達(dá)及敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞株，qRT-PCR法檢測(cè)PHF10對(duì)胃上皮分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

6、；透射電鏡（TEM）檢測(cè)胃癌細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化；Sphere形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞Sphere形成能力改變；裸鼠皮下種植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞體內(nèi)腺管形成能力變化。用 qRT-PCR和蛋白免疫印跡（WB）檢測(cè)相關(guān)通路基因表達(dá)變化；用免疫共沉淀(Co-IP)檢測(cè)蛋白之間相互作用；用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)檢測(cè)蛋白與基因啟動(dòng)子區(qū)域相互作用；另外，本研究用IHC、WB及qRT-PCR檢測(cè)PHF10及其上下游基因在胃癌組織中的

7、表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果：本研究表明，PHF10在正常胃黏膜至胃癌的轉(zhuǎn)變過(guò)程中其表達(dá)水平逐漸增高，在胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與胃癌分化程度負(fù)相關(guān)；PHF10在胃癌中的表達(dá)強(qiáng)度與胃癌進(jìn)展及不良預(yù)后呈正相關(guān)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，敲低PHF10可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞表達(dá)胃上皮成熟分化相關(guān)標(biāo)志物，而抑制胃上皮干祖細(xì)胞或胃癌干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞出現(xiàn)分化樣亞細(xì)胞水平改變（透射電鏡），抑制胃癌細(xì)胞Sphere形成，促進(jìn)胃癌細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤形成腺管樣

8、結(jié)構(gòu)；過(guò)表達(dá)PHF10則抑制胃上皮成熟分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)干性標(biāo)志物表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞Sphere形成。為研究E2F1對(duì)PHF10的表達(dá)調(diào)控作用，上調(diào)胃癌細(xì)胞E2F1表達(dá)后，其PHF10 mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，敲低E2F1表達(dá)則PHF10 mRNA及蛋白表達(dá)均被下調(diào)；PHF10可以正反饋調(diào)控E2F1蛋白水平；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和ChIP-qPCR表明，E2F1可結(jié)合到PHF10啟動(dòng)子區(qū)域而激活PHF10基因轉(zhuǎn)錄。Co-IP證

9、實(shí)PHF10在胃癌細(xì)胞中參與染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物SWI/SNF的形成，并對(duì)穩(wěn)定該復(fù)合物具有重要作用；PHF10通過(guò)這一復(fù)合物介導(dǎo)了對(duì) ERK1/2通路負(fù)性調(diào)控因子 DUSP5的轉(zhuǎn)錄抑制，進(jìn)而上調(diào)ERK1/2磷酸化水平。胃癌組織中E2F1與PHF10二者表達(dá)正相關(guān)，而與DUSP5表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。對(duì)PHF10沉默胃癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)E2F1或敲低DUSP5，或?qū)HF10過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞敲低E2F1或過(guò)表達(dá)DUSP5，均可部分或完全逆轉(zhuǎn)PHF10介導(dǎo)的胃