干細胞源性纖維軟骨自組裝基體的構(gòu)建及力學性能研究.pdf

1、類似于關節(jié)軟骨，關節(jié)盤缺損后難以自我修復。目前常規(guī)的手術治療可造成病人的持續(xù)性疼痛和關節(jié)功能障礙，因此未來功能性顳下頜關節(jié)盤置換的發(fā)展是非常必要的。功能性修復關節(jié)盤組織因為組織工程技術的成熟發(fā)展而有了新的希望。在組織工程中，種子細胞—作為其理論中的三要素之一，對關節(jié)盤組織再生有著重要的影響。限于關節(jié)盤細胞高度分化性、體外培養(yǎng)迅速脫分化失去軟骨表型等特點，直接利用關節(jié)盤細胞對缺損組織進行修復面臨著細胞來源稀缺的難題。近年，間充質(zhì)干細胞的持

2、續(xù)深入研究，啟發(fā)了研究者對關節(jié)盤組織工程種子細胞來源的新思路?；诟杉毎亩嘞蚍只裕芯空咴噲D通過物理學、生物學、化學等因素實現(xiàn)對干細胞的誘導并應用于組織工程中。本次研究主要通過生長因子定向誘導及與山羊顳下頜關節(jié)盤細胞直接共培養(yǎng)兩種方法誘導并構(gòu)建自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細胞纖維軟骨基體，同時改善并提高干細胞源性基體的力學性能，為成功構(gòu)建干細胞源性關節(jié)盤組織用于臨床修復打下基礎。本研究證明了直接共培養(yǎng)體系與生長因子定向誘導干細胞源性基體具

3、有相似的力學性能，這為后期改善工程化關節(jié)盤的性能提供參考依據(jù)。內(nèi)容分為以下三個部分：
　　第一部分、percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法對山羊骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定比較
　　目的：比較percoll密度梯度離心法和全骨髓培養(yǎng)法體外培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細胞的純度并評估其生物學特性，為后期實驗摸清實驗條件并提供大量細胞源。
　　方法：無菌收取3-5月齡山羊股骨骨髓組織，分別采用percoll密度梯度離心法

4、和全骨髓培養(yǎng)法體外分離gBMSCs，相差顯微鏡下每日觀察細胞形態(tài)；取生長良好的P3代細胞，繪制細胞生長曲線；成纖維細胞集落形成單位實驗檢測其自我更新能力；流式細胞術檢測細胞表面標志物表達。
　　結(jié)果：兩組中原代及傳代細胞均呈漩渦狀排列生長，兩種分離方法獲得的P3代細胞“S”形生長曲線形態(tài)相似，全骨髓培養(yǎng)法分離的細胞在成纖維細胞集落形成能力中表現(xiàn)出更高的自我更新能力，流式結(jié)果顯示兩者表面標志表達相似，其中CD34、CD44均呈陽性表

5、達，而CD45呈陰性。
　　結(jié)論：不論密度梯度離心法還是全骨髓培養(yǎng)法，均可得到形態(tài)均一、具有自我更新潛力的gBMSCs。但原代培養(yǎng)過程中密度梯度離心法提取的細胞增殖速度慢，到第3代時除細胞自我更新能力外其余細胞生物學特性無明顯差異。
　　第二部分、TGF-β1、BMP-2聯(lián)合誘導對自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細胞纖維軟骨基體的影響
　　目的：誘導并構(gòu)建自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細胞纖維軟骨基體，觀察其生物學特征并檢測力學性能，期

6、望進一步探索新的途徑用于顳下頜關節(jié)盤組織工程的成功構(gòu)建。
　　方法：分離、培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)干細胞，RT-qPCR檢測軟骨相關基因表達水平；按5.5×106/井接種到預制瓊脂糖井內(nèi)，每日更換誘導液（10ng/mlTGF-β1,500ng/ml BMP-2,10-7M DEX,1×ITS,50mg/l ascorbic acid,40μg/ml proline,100μg/ml pyruvic acid,100U/ml penici

7、llin/100mg/ml streptomycin）培養(yǎng)至42d；于14d、28d、42d時觀察和檢測自組裝gBMSCs纖維軟骨基體形態(tài)、成分變化及基體抗壓縮力學性能。
　　結(jié)果：經(jīng)過14d誘導后，誘導組 RT-qPCR檢測軟骨相關基因（ColⅠ、ColⅡ、ColⅩ、SOX9、GAG）的相對表達量顯著高于對照組（P<0.01）。與之相反，oct-4表達水平在誘導組下降至對照組的19％（P<0.01）。與對照組相比，14d、28d

8、、42d時誘導組的組織學染色均顯示陽性，顯示基體分泌ECM糖胺多糖，14d、28d、42d時誘導組的Ⅰ型膠原免疫組織化學染色呈陽性，顯示經(jīng)誘導后基體可產(chǎn)生作為原生自然關節(jié)盤組織的主要成分Ⅰ型膠原。壓縮實驗顯示對照組基體的壓縮模量均小于相應時間點誘導組基體的壓縮模量（P<0.05）；對于誘導組，42d時基體壓縮模量最大。
　　結(jié)論：自組裝山羊骨髓間充質(zhì)干細胞纖維軟骨基體經(jīng)生長因子誘導成功構(gòu)建；基體經(jīng)誘導后分泌的ECM與自然關節(jié)盤相似

9、，體外培養(yǎng)42d時壓縮模量最大。
　　第三部分、干細胞源性自組裝顳下頜關節(jié)盤復合基體的力學性能研究
　　目的:改善并提高干細胞源性自組裝基體的力學性能，為成功構(gòu)建干細胞源性關節(jié)盤組織用于臨床修復提供細胞組成篩選及力學參數(shù)。
　　方法：分別構(gòu)建干細胞源性自組裝基體誘導組（10ng/mlTGF-β1,500ng/ml BMP-2,10-7M DEX,1×ITS,50mg/l ascorbic acid,40μg/ml pr

10、oline,100μg/ml pyruvic acid,100U/ml penicillin/100mg/ml streptomycin）和共培養(yǎng)組（gBMSCs：TMJ disc cells=2:1），體外培養(yǎng)42d后，觀察和檢測自組裝gBMSCs纖維軟骨基體形態(tài)、成分變化、基體剖面形貌及基體抗壓縮力學性能。
　　結(jié)果：體視顯微鏡鏡下觀察結(jié)果顯示除陰性對照組，其余各組基體呈類似規(guī)則球體，表面光滑連續(xù)，具有光澤感且輕觸有回彈；除陰

11、性對照組，其余各組組織學與免疫組織化學染色都成陽性，其中誘導組著色最深。說明各組自組裝基體可以分泌GAG及Ⅰ型膠原，且誘導組GAG和型膠原含量較共培養(yǎng)組高。掃描電鏡結(jié)果顯示自組裝基體相鄰細胞突觸接觸，細胞呈規(guī)則有序?qū)盈B排列，其中誘導組可見密集大量纖維同向排列呈一定走向，細胞多為層狀重疊分布；共培養(yǎng)組多為層狀細胞排列，但仍可見短而細的纖維分布。力學實驗結(jié)果顯示兩組抗壓縮性能均高于關節(jié)盤自組裝基體對照組（P<0.05），且誘導組抗壓縮性能明