ATRA通過調控腫瘤相關巨噬細胞極化抑制骨肉瘤轉移的作用研究.pdf

1、研究目的:骨肉瘤是一種好發(fā)于兒童或青少年時期最常見的高度惡性骨腫瘤，高轉移潛能是骨肉瘤最主要的特性，也是當前限制患者生存率進一步提高的關鍵因素。因此如何有效地控制轉移的發(fā)生一直是骨肉瘤治療研究領域的前沿熱點。抑制腫瘤相關巨噬細胞(TAM) M2型極化的抗腫瘤轉移策略受到廣泛關注，但在骨肉瘤的研究中尚處于起步階段，特別是TAM的M2型極化對骨肉瘤轉移的影響尚未見文獻報道。近年來研究報道全反武維甲酸（ATRA）可抑制多種腫瘤的侵襲和轉移過程

2、，但其分子機制并不明確，也無其抗骨肉瘤轉移的相關報道。本部分研究將首先考察巨噬細胞M2型極化對骨肉瘤轉移的影響，然后以巨噬細胞極化為模型研究ATRA對巨噬細胞極化的調控作用，并深入探討ATRA對骨肉瘤轉移的實驗治療作用，最后闡明ATRA抑制骨肉瘤轉移的分子機制。本課題旨在明確巨噬細胞極化調控骨肉瘤轉移的作用，并闡明ATRA干預巨噬細胞極化和骨肉瘤轉移的分子機制，為抗骨肉瘤轉移的治療提供新思路。
　　研究方法:本研究采用小鼠巨噬細胞

3、和骨肉瘤細胞株作為研究對象。(1) SRB法檢測ATRA對巨噬細胞增殖以及巨噬細胞條件培養(yǎng)基對骨肉瘤細胞增殖的影響;(2)通過流式細胞術檢測巨噬細胞膜表面抗原F4/80、CD206和CD86的表達來考察ATRA對巨噬細胞極化的影響;(3)H&E染色檢測骨肉瘤的肺轉移灶點;(4)免疫組化檢測腫瘤石蠟組織切片中巨噬細胞相關蛋白和MMP12蛋白的表達;(5)免疫熒光染色檢測冰凍切片樣本中巨噬細胞相關蛋白在腫瘤轉移組織里的表達;(6)Real-

4、time PCR檢測M1和M2型兩類巨噬細胞相關基因的mRNA表達水平;(7)Transwell小室法和劃痕修復檢測骨肉瘤細胞的運動遷移及侵襲能力;(8)建立鼠源性骨肉瘤細胞K7M2 WT的balb/c小鼠尾靜脈或原位接種模型來模擬骨肉瘤肺轉移情況，考察巨噬細胞對骨肉瘤轉移的影響以及ATRA抗骨肉瘤轉移的作用;(9)表達譜芯片分析相關差異基因的表達;(10)ELISA檢測相關基質金屬蛋白酶的分泌情況。
　　研究結果:(1)采用尾靜

5、脈注射的方式將鼠源性骨肉瘤細胞株K7M2 WT單獨或與巨噬細胞混合后接種于balb/c小鼠建立了骨肉瘤肺轉移模型，在此模型上研究發(fā)現M2型巨噬細胞可以促進骨肉瘤肺轉移的發(fā)生。(2)體外采用傳代巨噬細胞系RAW264.7和原代巨噬細胞BMDM，應用經典的IL-13或IL-4誘導其發(fā)生M2型巨噬細胞極化，通過流式細胞術檢測M2型巨噬細胞標記物CD206，結果發(fā)現ATRA可有效抑制由IL-13或IL-4誘導的CD206表達，Real time

6、 PCR結果也證實了ATRA可以明顯抑制M2型巨噬細胞標記物MRC1和PPAR-γ的mRNA水平;另一方面，采用IFN-γ和LPS誘導的M1型巨噬細胞模型，發(fā)現ATRA可以一定程度上促進巨噬細胞系RAW264.7細胞的M1型極化，但對于原代巨噬細胞BMDM的M1型極化卻沒有影響。(3)進一步考察ATRA的體外抗骨肉瘤細胞轉移作用，研究結果表明ATRA可以抑制由IL-13或IL-4刺激的M2型巨噬細胞上清誘導的骨肉瘤細胞株的運動遷移能力。

7、(4)采用尾靜脈接種和原位接種鼠源性骨肉瘤細胞K7M2WT的balb/c小鼠建立了兩種骨肉瘤轉移模型，在這兩個動物模型上深入評價了ATRA在體內抗骨肉瘤肺轉移的作用。H&E染色檢測骨肉瘤肺轉移灶點數的統(tǒng)計結果表明ATRA在體內的抗骨肉瘤肺轉移作用十分良好，同時通過與巨噬細胞抑制劑氯膦酸鹽脂質體(Clodronate liposome)共同作用后，我們發(fā)現抑制腫瘤相關巨噬細胞M2型極化可能是ATRA阻斷骨肉瘤轉移作用的主要途徑。進一步免疫

8、組化結果證實ATRA可以有效抑制肺轉移組織中的M2型巨噬細胞，而對M1型巨噬細胞沒有顯著影響。(5)采用基因芯片分析探討了ATRA調控巨噬細胞極化的潛在機制，發(fā)現MMP12可能是其潛在作用靶點。ELISA結果顯示ATRA可以減少巨噬細胞中由IL-13刺激的MMP12分泌。引入MMP12抑制劑mmp408，發(fā)現mmp408可以有效抑制由IL-13和IL-4刺激的M2型巨噬細胞上清誘導的骨肉瘤細胞株K7M2 WT的運動遷移和侵襲能力。免疫組