肺結(jié)核病人DNA低甲基化趨勢(shì)與DNA去甲基化酶的相關(guān)性研究.pdf

1、肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis，PTB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)感染引起的一種與機(jī)體細(xì)免疫應(yīng)答密切相關(guān)的慢性感染性疾病，在肺結(jié)核病的發(fā)病過(guò)程中，細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體時(shí)，抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)將結(jié)核分枝桿菌抗原通過(guò)抗原-MHC分子復(fù)合物和CD28-CD80雙途徑激活

2、T淋巴細(xì)胞，同時(shí)分泌IL-12、IL-1等細(xì)胞因子，進(jìn)一步刺激免疫細(xì)胞釋放效應(yīng)分子如TNF-α等以殺滅結(jié)核分枝桿菌。
　　DNA甲基化修飾作為動(dòng)植物體內(nèi)一種重要的表觀遺傳修飾形式，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控，對(duì)腫瘤性疾病、慢性感染性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。而DNA甲基化主要通過(guò)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)上調(diào)DNA甲基化水平;

3、通過(guò)DNA去甲基化酶(TET1、TET2、TET3、TDG)下調(diào)DNA甲基化水平，兩方面的調(diào)節(jié)共同維持DNA甲基化水平的高低。
　　課題組在前期通過(guò)全基因組DNA甲基化芯片研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核病患者宿主基因普遍呈低DNA甲基化狀態(tài)。為進(jìn)一步探索肺結(jié)核病人DNA甲基化調(diào)節(jié)的分子機(jī)制、研究肺結(jié)核病人DNA低甲基化狀態(tài)的影響因素，本研究在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，收集健康對(duì)照（γ干擾素釋放實(shí)驗(yàn)，即IGRA陰性）和活動(dòng)性肺結(jié)核病人治療前全血RNA

4、，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法，首先對(duì)參與DNA甲基化下調(diào)的DNA去甲基化酶的4個(gè)基因進(jìn)行定量檢測(cè)，以初步明確DNA低甲基化狀態(tài)與DNA去甲基化酶之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肺結(jié)核病人組中，參與下調(diào)DNA甲基化水平的4個(gè)基因(TET1、TET2、TET3、TDG)表達(dá)均顯著升高（p值＜0.05）。為了全面探討肺結(jié)核病人DNA低甲基化狀態(tài)的影響因素，我們又對(duì)可以被動(dòng)影響DNA低甲基化狀態(tài)的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的3個(gè)基

5、因(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):只有DNMT1表達(dá)顯著升高（p值＜0.05）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，我們利用H37Rv裂解抗原以及體外降低DNA甲基化水平的5-氮雜胞嘧啶核苷(5azac)刺激物刺激A549、Beas-2B兩種細(xì)胞系，并收集刺激后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞DNA、RNA。利用甲基化敏感性限制性分析(MSRA)對(duì)所收集DNA樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明， H37Rv抗原、5azac導(dǎo)致DNA甲基化水平降低，且

6、刺激時(shí)間越長(zhǎng)甲基化降低越明顯。我們利用Real-time PCR(RT-PCR)方法對(duì)RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在兩株細(xì)胞中，DNA去甲基化酶隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的時(shí)間動(dòng)態(tài)圖卻無(wú)明顯特異性表達(dá)。且結(jié)果中在刺激第四天A549細(xì)胞中H37Rv刺激組DNA去甲基化酶TET2、TET3上調(diào)，而在Beas-2B中為H37Rv刺激組DNA去甲基化酶TDG上調(diào)，即DNA去甲基化酶表達(dá)顯著升高，這與臨床檢測(cè)結(jié)果相符;在

7、A549細(xì)胞H37Rv刺激組有兩種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A、DNMT3B上調(diào)，而在Beas-2B細(xì)胞H37Rv刺激組中表現(xiàn)為DNMT3A下調(diào)。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是臨床肺結(jié)核病人組還是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)H37Rv刺激組，DNA甲基化水平呈下降趨勢(shì)，而DNA去甲基化酶差異性表達(dá)上調(diào)。并且在細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)中，隨刺激時(shí)間越長(zhǎng)，DNA去甲基化酶表達(dá)逐漸升高，而DNA甲基化降低程度逐漸明顯?？傊?，本研究驗(yàn)證了肺結(jié)核病人DNA甲基化呈現(xiàn)