MUC1對人結腸癌細胞HCT116生物學行為的影響.pdf

1、目的:本課題采用MUC1表達陰性的結腸癌細胞株HCT116，通過慢病毒轉染，獲得穩(wěn)定表達MUC1的HCT116細胞株，觀察MUC1對細胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響，為以MUC1為靶點的結腸癌治療提供實驗室依據。
　　方法:
　　1.構建穩(wěn)定表達MUC1的HCT116細胞株：
　　(1) MUC1慢病毒載體的構建：通過Genebank查詢人MUC1基因，選取恰當的質粒，PCR擴增目的基因，將目的基因與慢病毒質粒雙酶切后

2、構建重組質粒并鑒定，之后轉染293T細胞進行慢病毒包裝，并測定病毒滴度。
　　(2)慢病毒轉染HCT116細胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞株。
　　(3)采用半定量RT-PCR、Western Blot進行MUC1表達的鑒定。
　　2. MUC1對腫瘤細胞生物學行為的影響：
　　(1)實驗分組：MUC1病毒組和空病毒組。
　　(2) CCK實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測兩組細胞的增殖能力。
　　(3) Tra

3、nswell侵襲實驗檢測兩組細胞的侵襲能力。
　　3. MUC1對奧沙利鉑敏感性的影響：MTT實驗檢測兩組細胞對奧沙利鉑的敏感性，流式細胞儀檢測奧沙鉑處理后兩組細胞凋亡率，酶底物法檢測奧沙利鉑處理后兩組細胞Caspase-3活性水平。
　　結果:
　　1.獲得穩(wěn)定表達MUC1的HCT116細胞株。
　　2.兩組細胞貼壁生長無差異。MUC1病毒組細胞軟克隆形成數與空病毒組相比有明顯差異［(26.0±2.31) vs

4、(5.67±1.45)（P<0.05）］。
　　3. MUC1病毒組穿過小室纖維素膜的細胞數與空病毒組相比有明顯差異［(27.3±4.41) vs(81.0±8.14)（P<0.05）］。
　　4.兩組細胞奧沙利鉑作用24h后 IC50分別為：空病毒組 IC50（14.27±0.25）ug/mL，MUC1病毒組IC50（26.03±0.20）ug/mL。奧沙利鉑（5ug/mL）處理細胞36h后，流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡，

5、凋亡率分別為(26.6±1.22)，(18.5±1.44)（P<0.05）；奧沙利鉑（5ug/mL）處理細胞36h后，酶底物反應法檢測兩組細胞Caspase-3活性，兩組細胞Caspase-3(U)分別為:(16.56±0.73)，(7.110±0.49)（P<0.05）。
　　結論:轉染 MUC1后細胞的軟瓊脂克隆形成能力明顯增高、侵襲能力增強以及對奧沙利鉑的化療敏感性降低。初步探討MUC1耐藥機制發(fā)現可能與Caspase-3活