GCS通過影響B(tài)CL-2的表達介導結腸癌細胞的多藥耐藥.pdf

1、背景與目的：
　　在現(xiàn)階段，化療依然是治療終末期腫瘤的主要手段，而腫瘤細胞多藥耐藥的形成是導致化療失敗的直接原因，導致預后不良。多藥耐藥（MDR）是指腫瘤細胞在對某一種化療藥物產生耐藥后，對其他化學作用原理不同、結構各異的抗腫瘤藥物產生交叉耐藥的現(xiàn)象。神經酰胺在抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡方面起著重要作用，而葡萄糖神經酰胺合成酶（GCS）可以催化神經酰胺糖基化生成葡萄糖神經酰胺（GlcCer），從而可以逃避神經酰胺介導的腫瘤凋亡。越

2、來越多的證據(jù)表明，腫瘤細胞多藥耐藥的形成與細胞內葡萄糖神經酰胺合成酶水平升高有著密切的關系。細胞中ERK蛋白的高表達可以促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調，作用于細胞凋亡的下游共同通路，發(fā)揮抗凋亡作用，Bcl-2的抗凋亡作用已被證實參與腫瘤細胞多藥耐藥的形成，有文獻報道，白血病耐藥細胞中存在GCS與Bcl-2的共同高表達[1]。但目前GCS與Bcl-2的關系及作用機制在結直腸癌中報道甚少。
　　本研究旨在通過檢測結腸癌敏感株細胞H

3、CT-8、耐藥細胞HCT-8/VCR及加入GCS抑制劑PPMP后，各組細胞中GCS、Bcl-2及ERK的表達情況，探討其相互關系及可能的作用機制。
　　方法：
　　1細胞株的培養(yǎng)
　　1）HCT-8組：結腸癌敏感細胞HCT-8在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含青霉素、鏈霉素各100 U/mL)中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度。至少培養(yǎng)2周后，取對數(shù)期生長良好的細胞進行實驗。

4、r>　　2）HCT-8/VCR組：結腸癌耐藥細胞HCT-8/VCR在含1.0μg/ml VCR的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以維持其耐藥性。實驗在脫藥培養(yǎng)2周，取對數(shù)期生長良好的細胞進行。
　　3）HCT-8/VCR+PPMP組：HCT-8/VCR細胞株脫藥培養(yǎng)后，繼續(xù)在含有20μmol/L PPMP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后進行實驗。
　　2蛋白質印跡法（Western Blot）
　　收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-

5、8/VCR+PPMP組細胞，提取總蛋白，Western Blot檢測各組細胞GCS、Bcl-2及ERK蛋白的表達情況。
　　3熒光定量PCR法（RT-qPCR）
　　收集HCT-8組、HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組的細胞，提取RNA，RT-qPCR檢測各組細胞GCS、Bcl-2及ERK基因的表達情況。
　　結果：
　　1．結腸癌敏感細胞HCT-8及耐藥細胞HCT-8/VCR中均有GCS和抗凋

6、亡蛋白 Bcl-2的表達，耐藥細胞株中 GCS的表達高于敏感細胞株，差異顯著（P＜0.05）；并且Bcl-2在耐藥株中的表達也明顯高于敏感株細胞（P＜0.05），與GCS具有一致性。
　　2．HCT-8/VCR組與 HCT-8/VCR+PPMP組相比，加入 GCS抑制劑 PPMP后，明顯抑制了 GCS的表達（P＜0.05）；同時，在 HCT-8/VCR+PPMP組抗凋亡蛋白Bcl-2與ERK蛋白的表達較HCT-8/VCR組下降（P

7、＜0.05）。
　　3．RT-qPCR檢測HCT-8/VCR組與HCT-8組目的基因，結果顯示：耐藥組細胞中GCS、Bcl-2及ERK基因都高于其親本細胞組，且差異顯著（P＜0.05）。
　　4．HCT-8/VCR組和HCT-8/VCR+PPMP組相比，加入抑制劑組的細胞內GCS mRNA的表達量明顯低于HCT-8/VCR組（P＜0.05）；加入抑制劑PPMP后，細胞內Bcl-2和ERK基因的表達也較耐藥細胞組明顯下調（P＜