睪丸內注射轉染EGFP基因及其在精子中表達的研究.pdf

1、背景和目的：目前實驗室制備轉基因動物常用方法仍然是原核顯微注射法。但該方法需要使用昂貴的顯微注射儀，技術要求較高，外源基因整合率低，整合有較大的隨機性。此外，犬等動物卵母細胞或受精卵胞漿中富含脂質，在顯微鏡下不易看到原核，使此技術在一定程度上受到了限制。因此，為了制備轉基因犬，我們以雄性動物為對象，運用雄性配子的生精與遺傳原理，采用睪丸內直接注射法，制備通過精原干細胞介導的轉基因動物。利用精原干細胞介導的轉基因技術是轉基因動物制作的一條

2、嶄新途徑，特別是對那些人工難以調控繁殖活動動物的轉基因研究具有十分重要的意義。 方法：通過探討不同年齡、不同注射方法和不同注射量對轉染后小鼠的生殖能力的影響，挑選合適年齡小鼠用于轉基因研究。通過冰凍切片和PCR檢測，觀察小鼠EGFP基因整合情況。 在對小鼠睪丸內注射法優(yōu)化的基礎上，我們以畢格犬為實驗對象，探討了不同量的DNA轉染后對精液品質、睪丸組織的影響，以及轉染后在睪丸組織和精子中的表達情況，以篩選出最合適的注射

3、劑量。研究睪丸內直接注射法的可行性，優(yōu)化睪丸內注射法。 結果：通過對5周齡和7周齡小鼠注射EGFP基因，發(fā)現注射后，7周齡小鼠的存活率和平均產仔數優(yōu)于5周齡小鼠。提示7周齡的小鼠為實驗的最佳年齡。我們將實驗小鼠的一側輸精管結扎不注射外源基因，僅注射未結扎一側睪丸，發(fā)現結扎、單側睪丸注射小鼠的生殖能力優(yōu)于不結扎的雙側注射小鼠。研究采用40μl和60μl基因轉染液注射小鼠睪丸，發(fā)現60μl的轉染液，使睪丸內的壓力變得很大，轉染液從

4、注射孔中流出，也對睪丸造成一定程度的損傷，使它的存活率、配種率和平均產仔數均低于40μl劑量組。取18只小鼠在注射后20天，每隔5天取睪丸組織，每次取三個樣，共取6次。通過熒光顯微鏡對冰凍切片觀察發(fā)現實驗鼠的睪丸中精原干細胞有EGFP基因表達。 選取10只性欲旺盛的2-3歲的畢格公犬，分成5組，每組兩只(一只用于精液采集，另一只用于冰凍切片的制作)，一側結扎，分別對未結扎側注射200μg、300μg.400μg、500μg、6

5、00μg五種不同劑量的DNA(一次)，每隔四天注射一次，共注射三次。經50，60，70，80天收集精液，進行精液品質評價。結果顯示200μg、300μg處理劑量組，犬的精液品質與處理前相比沒有明顯變化。而400μg、500μg、600μg處理劑量組，特別是500μg、600μg處理劑量組犬的平均精液射精量、密度、活力和外觀色澤與處理前相比，下降比較明顯。對收集的精液熒光顯微鏡下觀察發(fā)現，在注射400μg劑量質粒的犬(W219)，在注射后

6、60-70天時收集的鮮精有微弱的EGFP表達，其余樣本均未見EGFP表達。睪丸內注射30天后，每組劑量各取一只犬的睪丸制作冰凍切片，和未注射的正常犬的睪丸比較，結果顯示500μg、600μg劑量，對犬睪丸組織有一定的損傷，曲細精管呈散在狀。通過熒光顯微鏡檢查發(fā)現，400μg劑量組睪丸中精原干細胞有EGFP基因表達，綜上所述，得出400μg劑量是犬睪丸內注射的最適劑量。 結論：本研究針對可能影響犬和小鼠睪丸內注射介導EGFP基因