樹鼩CD4蛋白多克隆抗體的制備及檢測.pdf

1、樹鼩是一種酷似松鼠，跟人類有較近的親緣關(guān)系的哺乳綱攀鼩目動物。因其體型較小、容易馴養(yǎng)、且繁殖周期較短、飼養(yǎng)成本低等優(yōu)勢，樹鼩慢慢地被人類用于多種感染性疾病模型的建立，如乙型肝炎病毒感染模型、腸道病毒EV71型感染模型等。目前，針對樹鼩免疫系統(tǒng)，特別是一些免疫相關(guān)分子的研究較少，這嚴重阻礙了樹鼩作為一種理想的感染動物模型的進一步應(yīng)用。而在病毒感染過程中，CD4分子作為T細胞受體識別抗原復(fù)合物，在抗感染免疫中發(fā)揮重要的作用;同時關(guān)于樹鼩CD

2、4蛋白的表達以及抗體的制備尚未有文獻報道。因此，本實驗首先對CD4蛋白進行了序列分析，同時完成了樹鼩CD4蛋白的表達純化及多克隆抗體的制備。本文通過分離樹鼩的外周血淋巴細胞并提取淋巴細胞總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增得到帶有酶切位點的CD4序列。并將樹鼩CD4基因插入質(zhì)粒pGEX-5X-1和pET-30a(+)中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-5X-1-CD4和pET-30a(+)-CD4，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21和BL21(DE3)中，IP

3、TG誘導表達，并純化帶有GST標簽和His標簽的CD4重組蛋白GST-CD4和His-CD4。以GST-CD4作為免疫原，并與不同的佐劑(MF59、Al(OH)3、弗氏佐劑）組合免疫BALB/c小鼠，獲得多克隆抗體。通過間接ELISA法檢測血清抗體效價，同時根據(jù)各組血清抗體效價來比較不同佐劑對CD4蛋白誘導的抗原特異性體液免疫應(yīng)答的增強效應(yīng)。通過Western blot方法檢測多克隆抗體與體外原核表達的CD4重組蛋白和各種屬（樹鼩、人、

4、猴、大鼠和小鼠）體內(nèi)的CD4蛋白的結(jié)合能力。
　　經(jīng)過以上實驗，獲得了重組表達質(zhì)粒pGEX-5X-1-CD4和pET-30a(+)-CD4;表達的GST-CD4為可溶性表達，而His-CD4蛋白以包涵體形式存在，兩種重組蛋白GST-CD4和His-CD4相對分子質(zhì)量分別約為70000和53500，純化后蛋白濃度分別為1mg/ml和600μg/ml;免疫后，三組佐劑均能誘導產(chǎn)生抗體，且抗血清效價較高，其中弗氏佐劑組的ELISA效價最

5、高能達到1∶163840;三組佐劑的抗血清幾何平均滴度的比較結(jié)果為:弗氏佐劑組(GMT:97420)＞Al(OH)3佐劑組(GMT:67202)＞MF59佐劑組(GMT:55128);其中弗氏佐劑組顯著高于原蛋白組(P＜0.001);Al(OH)3組顯著高于原蛋白組(P＜0.01);而MF59組顯著高于原蛋白組(P＜0.05）;制備了特異性良好的小鼠抗血清，能夠特異性地結(jié)合樹鼩的CD4蛋白，且無種屬交叉反應(yīng)。
　　綜上所述，本實驗