耐受性樹突狀細胞誘導免疫性血小板減少癥小鼠免疫耐受的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是免疫穩(wěn)態(tài)的調節(jié)細胞，可以激活初始T細胞。可以誘導自身免疫耐受的DCs叫作耐受性樹突狀細胞(tolerogenicdendritic cells，tDCs)。tDCs低表達MHCⅡ分子和共刺激分子，并在自身免疫病中發(fā)揮強有力的免疫調控能力。
　　免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是一種臨床常見的出血性疾病，以免疫介導

2、的血小板破壞和/或血小板生成抑制為主要特點。其主要的發(fā)病機制是識別自身血小板抗原的自身反應性T細胞被激活，導致對自身血小板抗原的免疫耐受被打破。最近研究顯示，tDCs作為一種免疫細胞用于自身免疫紊亂的治療已取得成功，如自身免疫性腦脊髓炎、膠原或佐劑誘發(fā)的關節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病等已有臨床試驗報道。
　　我們參照國外有關文獻，用不同的細胞因子體外誘導產生tDCs，用主動免疫法建立ITP動物模型，研究tDCs對ITP的防治作用，并探討其可能

3、機制。
　　研究目的:
　　1.探討不同細胞因子在誘導培養(yǎng)小鼠骨髓耐受性樹突狀細胞(tolerogenicdendritic cells，tDCs)中的作用，觀察不同因子組合培養(yǎng)條件下tDCs的形態(tài)學、細胞表型和功能變化，尋找培養(yǎng)細胞所需要的最佳細胞因子;
　　2.建立免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)小鼠模型，觀察血小板數(shù)目、血小板平均體積等臨床指標的變化;
　　3.探

4、討TGF-β1和IL-10聯(lián)合誘導的tDCs在ITP小鼠模型治療中的作用及其機制。
　　研究方法:
　　1.tDCs的誘導培養(yǎng):采用C57BL/6小鼠的骨髓細胞，分離單個核細胞。在含GM-CSF、IL-4、TGF-β1、IL-10或TGF-β1和IL-10兩種因子聯(lián)合的RPMI1640培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)小鼠骨髓tDCs，按不同的組合分為五組進行體外誘導培養(yǎng):imDC組(GM-CSF+IL-4)、mDC組(GM-CSF+IL-4

5、+LPS)、10-DCs組(GM-CSF+IL-4+IL-10)、T-DCs組(GM-CSF+IL-4+ TGF-β1)、10T-DCs組(GM-CSF+IL-4+ IL-10+TGF-β1)。并利用GFP慢病毒感染tDCs細胞。光鏡及熒光顯微鏡下動態(tài)觀察細胞形態(tài)，流式細胞術檢測細胞CD80、CD86、I-A/I-E、CDllc、PD-L1、ILT3表達，WST法檢測各組DC細胞刺激淋巴細胞增殖活性，qRT-PCR法檢測IL-12和CC

6、R7的mRNA表達水平，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β的分泌水平和混合淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平。
　　2.ITP小鼠模型的建立:應用抗血小板自身抗體MWReg30抗體（模型組）或PBS（對照組）腹腔免疫BALB/c純種小鼠，分別于免疫后的第1h，3h，24h，48h，72h，96h，120h取血檢測血常規(guī)，監(jiān)測血小板計數(shù)及平均血小板體積(MPV)水平的變化，并應用流式細胞

7、術檢測血小板相關抗體(PAIgG)，應用ELISA法檢測外周血中Th1相關細胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型細胞因子IL-4、IL-10及TGF-β水平，同時觀察骨髓細胞形態(tài)學，尤其是巨核細胞系的數(shù)量和發(fā)育情況。
　　3.tDCs在ITP小鼠模型治療中的作用及其機制研究:ITP小鼠體內輸注GFP慢病毒轉染后的用GM-CSF、IL-4、IL-10、TGF-β細胞因子體外聯(lián)合培養(yǎng)誘導的小鼠tDCs。實驗分兩組:治療組(輸tDCs)

8、和對照組(輸PBS)。輸注抗體1h后接受細胞或PBS治療，免疫熒光進行細胞體內定位的研究;于免疫后的第1h，3h，24h，48h，72h，96h，120h取血監(jiān)測血小板計數(shù)，應用ELISA檢測外周血中Th1相關細胞因子IFN-γ、IL-2和Th2型細胞因子IL-4、IL-10及TGF-β水平;流式細胞術檢測外周血中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞的比例。
　　結果:
　　1.小鼠骨髓來源的單個核細胞，體外經(jīng)GM-

9、CSF、IL-4、IL-10和/或TGFβ聯(lián)合誘導培養(yǎng)可生成耐受性樹突細胞(tDCs)。
　　2.各組tDCs的特點:1）10-DCs，與mDCs相比，高表達DCs的特異性標記物CD11c，低表達I-A/I-E和共刺激分子CD80和CD86，高表達抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴細胞增殖的能力降低;產生較低的IL-12和CCR7;分泌較高水平的IL-10和TGFβ;與淋巴細胞共培養(yǎng)上清中，IFNγ的水平較低，IL-10的水

10、平較高，但TGFβ的水平未有顯著變化。
　　2) T-DCs，與mDCs相比，高表達DCs的特異性標記物CD11c，低表達I-A/I-E和共刺激分子CD80，高表達抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴細胞增殖的能力未顯著降低;產生的IL-12和CCR7未有顯著變化;分泌較高水平的TGFβ，IL-10的分泌量未有顯著變化;與淋巴細胞共培養(yǎng)上清中，IFNα的水平較低，IL-10和TGFβ的水平較高。
　　3)10T-DCs，

11、與mDCs相比，高表達DCs的特異性標記物CD11c，低表達I-A/I-E和共刺激分子CD80和CD86，高表達抑制性分子PD-L1和ILT3;刺激淋巴細胞增殖的能力降低;產生較低的IL-12，CCR7的表達無明顯變化;分泌較高水平的IL-10和TGFβ;與淋巴細胞共培養(yǎng)上清中，IFNγ的水平較低，IL-10和TGFβ的水平較高。
　　3.ITP小鼠模型的建立和相關檢測:1）GFP慢病毒轉染tDCs后，細胞成功呈現(xiàn)綠色熒光，且并未

12、改變細胞的表型。
　　2) BALB/c小鼠接受MWReg30抗體腹腔注射，與對照組相比，1h后血小板數(shù)出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，并在48h達到最低點，與對照組存在顯著性差異(P＜0.001)。并于120h回升至正常。
　　3)造模時，隨著血小板計數(shù)的下降，血小板平均體積相應的增大，至24h時已與對照組存在顯著性差異(P＜0.05)，并于48h達到最大值并持續(xù)至120h(P＜0.001)，且血小板平均體積與血小板計數(shù)存在

13、負相關關系。而骨髓巨核細胞形態(tài)和數(shù)量均無顯著變化。
　　4)造模組小鼠體內的PAIgG水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5)造模組小鼠血清中IFN-γ和IL-4的水平均出現(xiàn)不同程度的升高。與小鼠未接受抗體注射(0 h)時的因子水平相比，IFN-γ在注射抗體3h后即出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，至120h恢復正常;而IL-4則在注射抗體24h后出現(xiàn)升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，至96h恢復正常。而IL-

14、2、IL-10及TGF-β因子水平均無明顯變化。
　　4.tDCs在ITP小鼠模型治療中的作用及其機制
　　1)10T-DCs治療組相比較PBS對照組明顯增加了ITP小鼠的血小板數(shù)目。
　　2)10T-DCs治療組小鼠外周血血清中的IFN-γ水平，相比較PBS對照組小鼠，在接受MWReg30抗體注射后3h、24h、48h、72h均有不同程度的下降，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而IL-4、IL-2、IL-10及T

15、GF-β其他因子水平均無明顯變化。
　　3)在熒光顯微鏡下觀察，10T-DCs治療組小鼠的脾臟內可見呈綠色熒光細胞。
　　4)10T-DCs治療組小鼠外周血中Treg細胞的比例較PBS對照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.GM-CSF、IL-4、IL-10和TGFβ聯(lián)合誘導培養(yǎng)的tDCs效果最佳。
　　2.建立了理想并穩(wěn)定的ITP小鼠模型，為ITP細胞治療的后續(xù)研究提供了有力的保障。<