p38絲裂原活化蛋白激酶通路及其下游因子NF-κB對(duì)紫杉醇誘發(fā)細(xì)胞凋亡中γ-氨基丁酸B型受體表達(dá)變化的影響.pdf

1、目的:通過(guò)特異性給予p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPKs)抑制劑(SB203580)和核因子kB(NF-kB)抑制劑(SN50)的方法，探討紫杉醇誘發(fā)細(xì)胞凋亡中p38MAPKs通路及其下游因子NF-kB對(duì)γ-氨基丁酸B型(GABAB)受體表達(dá)變化的影響。
　　方法:SD大鼠新生24h，斷頭取腦，用含有木瓜蛋白酶（瑞士，Acros公司）的DMEM浸泡已經(jīng)分離好的海馬組織，放入培養(yǎng)箱30min。機(jī)械吹打后種植于多聚賴氨酸包被好的

2、培養(yǎng)板中，6～8h更換含有雙抗（美國(guó)，Gibco公司）和人白細(xì)胞抗原(B27)（美國(guó)，Gibco公司）的Neurobasal（美國(guó)，Invitrogen公司）培養(yǎng)基。隨后，每間隔兩天更換細(xì)胞培養(yǎng)液（半量更換），并用光學(xué)顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)5天后用于實(shí)驗(yàn)。選取原代培養(yǎng)5d、濃度約為1×106/ml的海馬細(xì)胞，給予不同濃度（0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）紫杉醇，采用MTT法及流式細(xì)

3、胞儀檢測(cè)法分別檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞抑制率及凋亡率變化，以確定紫杉醇誘發(fā)細(xì)胞凋亡的最適條件（最適濃度及處理時(shí)間），作為蛋白測(cè)定的實(shí)驗(yàn)條件。憑據(jù)MTT比色法檢測(cè)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組AD值/對(duì)照組AD值）×100％，然后用改良寇氏公式(lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)）計(jì)算神經(jīng)元的半數(shù)抑制濃度(IC50)，用IC50作為紫杉醇最適濃度用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，觀察不同藥物濃度作用不同時(shí)間對(duì)神經(jīng)元抑

4、制率的影響，計(jì)算其均數(shù);憑據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)法所測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）為橫坐標(biāo)軸，PI為縱坐標(biāo)軸，左上側(cè)的象限為機(jī)械性的損傷細(xì)胞;右上側(cè)的象限為晚期的凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞;左下側(cè)的象限為正常陰性的細(xì)胞;右下側(cè)的象限為早期的凋亡細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡率驗(yàn)證MTT比色法檢計(jì)算的紫杉醇最適濃度的可靠性。另選取原代培養(yǎng)5d的海馬細(xì)胞隨機(jī)分為六組:對(duì)照組（C組），10μmol/L SB203580處理組（K1組），53

5、μg/ml SN50處理組（K2組），紫杉醇最適濃度處理組（N組），10μmol/L SB203580+紫杉醇最適濃度混合組（K1+N組），53μg/ml SN50+紫杉醇最適濃度混合組(K2+N組)。培養(yǎng)時(shí)間為24h，保持各組加液量一致，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot法)測(cè)定海馬神經(jīng)元細(xì)胞的GABAB受體及核因子kB(NF-kB)蛋白表達(dá)相關(guān)水平（n=5，(x)±s）。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元起初小而圓、透亮并

6、懸浮在細(xì)胞液中。24h后可通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察到大部分細(xì)胞為梭形并長(zhǎng)出細(xì)長(zhǎng)突起。3天后胞漿豐富，突起較前明顯增粗、增長(zhǎng)。5天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，神經(jīng)元胞體豐滿，突起交織成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)。紫杉醇抑制海馬神經(jīng)元活力是與時(shí)間和濃度交互相關(guān)的(F=9.127，P＜0.05)。在對(duì)凋亡率的分析中，由于右上象限中包含晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞，所以本實(shí)驗(yàn)中凋亡率的測(cè)定主要依據(jù)右下象限的早期凋亡細(xì)胞。1μmol/L紫杉醇處理24h誘發(fā)的細(xì)胞早期凋亡率為(48

7、.63±5.76)％，為測(cè)定NF-kB及GABAB受體蛋白的實(shí)驗(yàn)條件。蛋白表達(dá)結(jié)果:與C組相比，N組、K1+N組和K2+N組NF-kB與GABAB受體表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)，而K1組和K2組NF-kB與GABAB受體表達(dá)均降低(P＜0.05);與K1組相比，N組和K1+N組NF-kB和GABAB受體表達(dá)均增高(P＜0.05);與K2組相比，N組和K2+N組NF-kB和GABAB受體表達(dá)均增高(P＜0.05);與N組相比，K1+N