?；切苋パ跄懰釋IH3T3細胞成骨分化和礦化的影響研究.pdf

1、異位骨化（Ectopic ossification），是一種在非骨化組織中生成板層狀骨或鈣化復合物的一種病理狀態(tài)，其發(fā)生機制目前并不完全明確。從組織形態(tài)學分析，形成的這些異位骨與正常胚胎時期骨的形成和骨折后骨的再生類似，在性質上屬于軟骨內骨或膜內骨。目前，臨床中應用最多的兩種預防和治療方式是放射療法和吲哚美辛藥物治療，但這兩種治療方式存在嚴重的副作用，因此，更有效安全的治療方法急待發(fā)現。
　　研究表明，內質網應激反應能夠在成骨分化

2、和骨形成中發(fā)生并激活信號通路：PERK/eIF2α/ATF4，IRE1/XBP1s和ATF6介導的信號通路。通過對Perk-/-和ATF4-/-小鼠觀察發(fā)現，這些小鼠中存在嚴重的骨發(fā)育缺陷，主要是因為它們的成骨分化受抑制，重要的骨相關轉錄因子無法正常表達，蛋白分泌途徑受損，不能有效地表達、加工和分泌膠原蛋白、骨鈣素和骨涎蛋白等骨基質成分。在IRE1α-/-敲除的小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）中，同樣出現骨相關轉錄因子表達降低，成骨分化能

3、力及胞外骨基質蛋白（如骨鈣素，骨涎蛋白，骨橋蛋白等）表達受抑制的現象。雖然在 ATF6-/-小鼠中沒有表現出明顯的骨發(fā)育異常癥狀，但在 S1P-/-（ATF6的修飾酶之一）敲除小鼠中，成熟的Ⅱ型膠原表達嚴重下降，導致軟骨發(fā)育異常和軟骨內骨形成受抑制。
　　牛磺熊去氧膽酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)，廣泛存在于人和動物的膽汁中，是一種親水膽汁酸衍生物，具有保護肝細胞，拮抗疏水性膽汁酸的細胞毒作用

4、，促進膽汁酸轉運和分泌，在人體血液中的正常濃度范圍是0.4-4μM。研究表明，TUDCA能夠加強內質網中蛋白折疊的能力，抑制內質網應激反應（ER Stress）。TUDCA已經廣泛用于治療膽石癥，膽汁淤積性肝病等疾病，其作用機理就是抑制ER Stress反應，從而對疾病起到一定的抑制作用。在最近的報道中，Cai等人分析，在兔和鼠主動脈瓣（AV）鈣化模型中，?；切苋パ跄懰嵬ㄟ^對ER Stress的抑制作用，可減弱AV成骨細胞分化，顯著防止

5、主動脈瓣（AV）鈣化，通過體外研究證明，TUDCA通過抑制ER Stress，能抑制氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）誘導瓣膜間質細胞（VICS）向成骨細胞分化。
　　鑒于以上，我們提出假設，內質網應激（ER Stress）也許參與異位骨化的發(fā)生，內質網應激經典抑制劑?；切苋パ跄懰幔═UDCA）也許能夠通過抑制內質網應激反應來抑制異位骨化現象。因此，如果假設成立，?；切苋パ跄懰釋Ξ愇还腔嚓P疾病的治療和預防將發(fā)揮其巨大潛力。

6、　　因此，在本研究中，我們用含3mM無機磷酸鹽（Na3 PO4, Pi）的成骨培養(yǎng)液來誘導NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞作為異位骨化的體外模型。選擇不同濃度的TUDCA（0.1，1，5，10μM）干預成骨誘導的NIH3T3細胞的成骨分化和礦化，通過對NIH3T3礦化表型分析，探究TUDCA對異位礦化的影響。通過Western-Blot驗證了TUDCA干預作用下，對無機磷酸鹽（Na3 PO4，Pi）誘導的異位礦化模型中ER Stress激

7、活的三條信號通路中相關信號分子的表達的影響。同時，成骨分化相關重要的轉錄因子Runx2的表達也通過Western-Blot進行了驗證。
　　第一章 TUDCA對 NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞成骨分化和和礦化的影響
　　目的：檢測TUDCA對NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞成骨分化和和礦化的影響。
　　方法：用不同濃度的TUDCA作用于成骨誘導的NIH3T3細胞，用MTT法檢測細胞增殖情況，pNPP法檢測細胞內堿性磷酸酶

8、活性，茜素紅染色和定量檢測礦化結節(jié)的生成情況，鄰甲酚酞絡合酮法測定鈣離子沉積情況，RT-qPCR檢測相關礦化標記基因的表達。
　　結果：TUDCA劑量依賴性抑制成骨誘導的NIH3T3細胞的增殖，細胞內堿性磷酸酶活性，礦化結節(jié)的生成，鈣離子沉積和相關礦化標記基因的表達。
　　結論：小分子TUDCA能夠劑量依賴性抑制無機磷酸鹽（Na3PO4，Pi）誘導的NIH3T3細胞的增殖及成骨分化和礦化作用。
　　第二章TUDCA通過

9、抑制內質網應激反應抑制NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞成骨分化和和礦化
　　目的：檢測TUDCA是否通過抑制內質網應激反應來抑制NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞成骨分化和和礦化。
　　方法：Western-Blot法檢測無機磷酸鹽對ER Stress的激活情況，并檢測TUDCA干預作用下成骨誘導的 NIH3T3小鼠胚胎成纖維細胞成骨分化和和礦化的中 ER Stress反應活化的相關信號通路中重要信號分子的表達情況。
　　結