嗜酸性粒細胞促進造血干細胞動員的調控機制研究.pdf

1、支氣管哮喘是一種由過敏原引起的由嗜酸性粒細胞(eosinophil，Eos)，肥大細胞，T淋巴細胞等多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其臨床特點為氣道高反應性(hyperresponsiveness，AHR)，以及可逆性的氣流受限。導致其病理的根本原因是Eos的氣道局部的大量聚集，且Eos的數(shù)量與哮喘的嚴重程度相關。目前全球有3億多人患有哮喘，中國哮喘患者已超過4000萬。哮喘給家庭以及整個社會產(chǎn)生了嚴重的經(jīng)濟負擔。目前以吸入

2、型糖皮質激素為首選的治療方案可以較好的控制哮喘的癥狀，但尚不能完全根治。目前對哮喘發(fā)病機制，病理學以及防治仍然是本領域研究的挑戰(zhàn)，更好的研究Eos，并控制Eos為主的炎癥也是本領域研究的熱點。
　　Eos是外周血的成熟白細胞的一種，呈橢圓形，因其胞漿內部充滿粗大、整齊、均勻、排列緊密的嗜酸性顆粒而命名。正常人血液中嗜酸性粒細胞的水平較低，比例為白細胞總數(shù)的0.5％-5％，絕對值為0.05-0.5*10^9/L，Eos數(shù)量少但是作用

3、非常重要。目前已經(jīng)有很多關于Eos在哮喘中的病理機制研究，包括:聚集在氣道周圍的Eos釋放其特異性的胞質顆粒蛋白如主要堿性蛋白-1(major basic protein-1，MBP-1)，嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(eosinophil cationic protein，ECP)等破壞氣道上皮細胞等局部組織;釋放白介素-13(interlukin，IL-13)，IL-4等炎癥因子，刺激杯狀細胞增生，粘液高分泌以及AHR的產(chǎn)生;長期的慢性炎

4、癥過程中，Eos還分泌轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）等與組織修復有關的蛋白，導致局部平滑肌增生，纖維沉積等病理現(xiàn)象。
　　除參與哮喘的病理過程以外，Eos還在抗寄生蟲感染的宿主免疫反應中其重要作用，包括分泌MBP直接破壞寄生蟲細胞壁，分泌相應抗體而殺傷。Eos還是一種重要的免疫調節(jié)細胞，其功能包括激活肥大細胞，促進其分泌組胺和前列腺素等，參與后續(xù)的過敏性反應;以及處理并提呈

5、一系列微生物，病毒和寄生蟲抗原擔任抗原提呈細胞的角色;Eos還能調節(jié)T淋巴細胞的功能，活化的Eos可以促進免疫反應中T細胞的增殖，并通過提呈可溶性抗原給CD4+T細胞來調節(jié)Th1/2的極化。Eos還參與腫瘤的免疫反應過程，如通過招募CD8+的T細胞來促進腫瘤細胞的殺傷作用等。
　　Eos由造血干細胞在一系列復雜轉錄因子和細胞因子的調控之下定向分化而來，Eos是造血干細胞的終末成熟血細胞。二者之間除分化關系外并無其他研究報道。本團隊

6、前期研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的哮喘模型中，出現(xiàn)骨髓與外周脾臟干細胞LSK(lineageSca-1+c-kit+)數(shù)量的增加，即干細胞的增殖和動員現(xiàn)象。而在Eos缺失的Phil小鼠中，則發(fā)現(xiàn)干細胞數(shù)量的減少。提示Eos可能反過來對其上級的造血干細胞有一種促進動員調控作用?；诖思僭O，我們利用了IL-5過表達導致的Eos大量存在的NJ.1638小鼠與Phil小鼠進行了一系列骨髓移植，體外共培養(yǎng)體系等實驗，深入的研究了Eos與造血干細胞之間的調控關系

7、。
　　目的:
　　明確Eos對干細胞動員的調控作用，并進一步研究其機制。
　　方法:
　　1.整體模型
　　利用6-10周齡的同窩生的野生型(Wild Type，WT)小鼠與Phil小鼠，雌雄不限，以雞卵清蛋白(OVA)致敏以及霧化攻擊，建立經(jīng)典的哮喘模型，以多色流式分析法標記骨髓與脾臟來源的LSK水平的干細胞，觀察其增殖與動員的現(xiàn)象;分析NJ.1638體內的干細胞水平及其ROS水平，觀察Eos大量增加對

8、干細胞的影響;將NJ.1638與Phil小鼠雜交后分析骨髓與外周的干細胞水平，明確Eos對干細胞的調控關系;對WT和Phil小鼠腹腔注射經(jīng)典的骨髓動員劑G-CSF，觀察干細胞動員的現(xiàn)象。
　　2.骨髓移植
　　進行WT小鼠和NJ.1638小鼠之間的非競爭性和競爭性骨髓移植方案，觀察Eos與干細胞活化的關系及其干細胞的分化功能;利用DCFH FA熒光染料標記活性氧自由基(ROS)，檢測ROS水平;利用流式分選的方法純化LSK，

9、與Eos進行體外培養(yǎng)，觀察Eos對LSK的影響，找尋其機制。
　　結果:
　　1.哮喘模型中，Eos的缺失導致干細胞動員現(xiàn)象的減弱。表現(xiàn)為與WT小鼠相比，Phil小鼠脾臟中干細胞數(shù)量增加減少。
　　2.NJ.1638骨髓中LSK數(shù)量明顯減少，而脾臟中LSK的數(shù)量則高于骨髓，提示干細胞動員的現(xiàn)象;NJ.1638體內的干細胞呈高ROS水平。
　　3.NJ.1638與Phil小鼠雜交后體內高IL-5但缺乏Eos的小鼠中

10、，干細胞動員的現(xiàn)象消失，提示Eos與干細胞動員直接相關。
　　4.Eos不影響G-CSF導致的骨髓動員現(xiàn)象。
　　5.NJ.1638與WT小鼠的骨髓移植實驗說明Eos數(shù)量的變化與干細胞動員的趨勢直接相關，且NJ.1638來源的干細胞分化能力下降。
　　6.NJ.1638來源的干細胞歸巢能力并沒有下降。
　　7.Eos與流式分選后的LSK共培養(yǎng)可以促進其ROS的產(chǎn)生。
　　結論:
　　Eos數(shù)量的增加可