尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶在A549細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、研究背景:
　　尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltrans ferase，NAMPT），是哺乳動物細胞尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)補救合成途徑的限速酶，而NAD是細胞物質(zhì)能量代謝的重要輔酶。研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT與腫瘤的關(guān)系非常密切，相比于正常細胞，腫瘤細胞對物質(zhì)、能量的需求更高，因而對NAMPT的需求也更高。臨床研

2、究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤患者血清中的NAMPT水平顯著升高，且隨著腫瘤惡性程度的加深而增加，與預(yù)后呈負相關(guān)。有研究者認為可以將患者血清中的NAMPT水平作為評估腫瘤惡性程度的生物標記物。還有研究發(fā)現(xiàn)，NAMPT能夠促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及管腔形成，通過誘導(dǎo)ERK通路（Extracellular regulated protein kinase，ERK）和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP2/9)的活化，

3、促進血管增生，因而認為NAMPT對于腫瘤細胞的遷移有促進作用，這提示NAMPT與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系。目前，NAMPT特異性抑制劑FK866已經(jīng)進入Ⅱ期臨床試驗，F(xiàn)K866能通過特異性抑制NAMPT酶活性，使NAD的合成減少，從而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。研究者認為，F(xiàn)K866是極具應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。
　　腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移與多種因素有關(guān)，在惡性腫瘤的發(fā)展過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Tr

4、ansition，EMT）是腫瘤發(fā)生侵襲和向遠端轉(zhuǎn)移的一個重要步驟。然而，NAMPT及其抑制劑FK866對腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是否有影響，卻少有研究報道。本研究中，我們應(yīng)用FK866抑制細胞NAMPT酶活性、細胞外直接給予NAMPT蛋白作處理因素，觀察這些處理對非小細胞肺癌細胞株A549細胞發(fā)生EMT的影響，并初步探討這些處理影響A549細胞發(fā)生EMT的機制。
　　研究目的:
　　觀察尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)抑制

5、劑FK866及細胞外NAMPT在A549細胞發(fā)生EMT中的作用，并初步探討以上處理影響A549細胞發(fā)生EMT的機制。
　　研究方法:
　　1.探討抑制NAMPT酶活性對A549細胞發(fā)生EMT影響:
　　(1)使用TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT，建立EMT模型;采用RT-qPCR方法檢測FK866處理后，模型表達與EMT相關(guān)分子標記物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情況;
　　

6、(2)采用RT-qPCR方法檢測A549細胞以FK866不同濃度不同時間作用后，表達EMT相關(guān)分子標記物E-cadherin、vimentin和α-SMA的mRNA的情況;
　　(3)以RT-qPCR方法檢測FK866作用后A549細胞的TGF-β1表達;
　　(4)以NAMPT的底物NMN（模擬NAMPT酶活性增高）預(yù)處理A549細胞后，再以FK866給藥處理，觀察NMN能否逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT相關(guān)分子的表達變化;<

7、br>　　(5)以Western blotting檢測FK866處理A549細胞不同時間，細胞ERK1/2及p-ERK1/2的表達;并使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理，以進一步確證ERK通路激活參與調(diào)控FK866引起的A549細胞發(fā)生EMT;
　　(6)以RT-qPCR方法檢測FK866作用后A549細胞中EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Slug，Twist的表達;
　　2.探討細胞外NAMPT對A549細胞發(fā)生EMT的影響:<

8、br>　　(1)以基因重組的人NAMPT野生型蛋白、酶活性位點突變型蛋白(NAMPT/H247A)處理A549細胞，以TGF-β1為陽性對照，采用RT-qPCR檢測細胞上皮化標記物E-cadherin，間質(zhì)化標記物vimentin和α-SMA的表達。
　　(2)使用ERK抑制劑U0126預(yù)處理后，檢測上皮化標記物E-cadherin，間質(zhì)化標記物vimentin和α-SMA的表達情況。
　　(3)以基因重組的人NAMPT蛋白

9、野生型、酶活性位點突變型蛋白NAMPT/H247A（500 ng/ml）處理A549細胞，采用RT-qPCR檢測細胞轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Slug，Twist的表達。
　　研究結(jié)果:
　　1.抑制NAMPT酶活性可促進A549細胞發(fā)生EMT
　　(1) TGF-β1濃度依賴和時間依賴的誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT; FK866預(yù)處理并未能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT;
　　(2)單獨使用FK866處理A549細胞后

10、，細胞間質(zhì)化標記物vimentin與α-SMA的mRNA表達呈時間依賴性的顯著升高;
　　(3) FK86610 nM單獨使用處理A549細胞后，細胞表達TGF-β1明顯下降，表明較高濃度的FK866誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT其機制可能不涉及TGF-β1的上調(diào)表達;
　　(4)NMN能夠顯著逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT相關(guān)標記物的表達變化，提示FK866促進細胞發(fā)生EMT的機制涉及其對NAMPT酶活性的抑制;
　　(5)隨著FK

11、866作用時間的延長，細胞p-ERK1/2的表達顯著增加，且U0126預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)FK866引起的EMT標記物vimentin和α-SMA的mRNA表達上調(diào);提示FK866促進細胞發(fā)生EMT的機制涉及ERK通路激活;
　　(6) FK866(1nM)處理A549細胞72 h，可顯著上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Slug，Twist的表達，提示FK866促進細胞發(fā)生EMT的機制涉及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。
　　2.細胞

12、外NAMPT(eNAMPT)可促進A549細胞發(fā)生EMT
　　(1)人基因重組的NAMPT蛋白野生型(500 ng/ml)和酶活性位點突變型蛋白NAMPT/H247A(500 ng/ml)處理均可引起A549細胞上皮標記物E-cadherin的mRNA的表達顯著下降，間質(zhì)化標記物vimentin的mRNA的表達顯著增加;
　　(2) ERK抑制劑U0126預(yù)處理能夠顯著逆轉(zhuǎn)eNAMPT引起的E-cadherin和viment

13、in的mRNA表達變化;
　　(3)人基因重組的NAMPT蛋白野生型及酶活性位點突變型蛋白(NAMPT/H247A)(500 ng/ml)處理細胞后，轉(zhuǎn)錄因子Snail，Slug，Twist的表達均顯著增加。
　　結(jié)論:
　　1.NAMPT酶活性抑制劑FK866可誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT，其作用機制涉及對NAMPT酶活性抑制、ERK通路激活以及EMT相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。
　　2.細胞外較高濃度的NAMPT也