IL-17對小鼠結腸癌腫瘤組織中細胞因子表達及CD4+T細胞亞群分布的影響.pdf

1、目的:結腸癌是臨床上常見的消化道腫瘤之一，好發(fā)于50～60歲人群，占所有癌癥的第三位。[1，2]隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，由此帶來的飲食結構改變，如少纖維多脂肪，使得該病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)逐年升高趨勢。[3]目前對于結腸癌的治療仍以手術作為首選方式，術后或術前結合化學治療等輔助方法取得一定效果，但是其5年生存率低耐藥性強等諸多因素，[4]促使我們亟待尋求更為有效的治療手段。上個世紀80年代，腫瘤的生物治療問世，至

2、今已經(jīng)成為第四種腫瘤治療方法，而其中的免疫治療為最常用的方法之一。[5]免疫療法就是通過增強人體免疫力，調(diào)整機體抗瘤能力，達到抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移。細胞因子是一類具有多種生物學效應的小分子蛋白，其家族成員很多在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，[6]因此細胞因子治療已成為腫瘤免疫治療的常用手段之一。IL-17作為Th17細胞的特征性細胞因子，其在腫瘤中的作用引起了我們的興趣，前期研究結果顯示接種C26/pcDNA3.1-IL-17細

3、胞的小鼠移植瘤體積明顯小于接種C26細胞和C26/pcDNA3.1細胞的小鼠移植瘤大小，這說明IL-17可以抑制腫瘤的生長，但是IL-17并不影響各組小鼠的生存期。因此，本研究將對IL-17在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行深入研究，并探討其抗瘤機制。
　　方法:
　　1、荷瘤小鼠脾細胞亞群分布檢測
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細胞后35天，取各組小鼠脾臟，利用密度梯度離心法分離脾淋巴細胞，分別提取各組脾淋巴細胞的RNA，Real-

4、Time PCR法檢測與各Th細胞相關的特征性細胞因子和轉錄因子的表達。
　　2、IL-17對腫瘤組織中淋巴細胞浸潤情況檢測
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細胞后35天，取各組小鼠腫瘤組織，甲醛固定后制備蠟塊，切片后HE染色法觀察接種C26/pcDNA3.1-IL-17細胞的小鼠腫瘤組織與接種C26/pcDNA3.1細胞和接種C26細胞的小鼠腫瘤組織中淋巴細胞浸潤數(shù)量的區(qū)別。
　　3、IL-17對腫瘤組織中血管密度影響情況檢測<

5、br>　　荷瘤小鼠接種腫瘤細胞后35天，取各組小鼠腫瘤組織，甲醛固定后制備蠟塊，切片后免疫組化法標記血管，對比三組荷瘤小鼠腫瘤組織中血管數(shù)量。
　　4、荷瘤小鼠腫瘤組織中相關細胞因子檢測
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細胞后35天，Real-Time PCR法和Western blot法檢測腫瘤組織中相關細胞因子的表達情況。
　　5、荷瘤小鼠腫瘤組織中Th1，Th2，Th17，Treg細胞特征性轉錄因子的表達情況檢測
　　

6、荷瘤小鼠接種腫瘤細胞后35天，分別取各組小鼠腫瘤組織，Real-TimePCR法分別檢測Th1、Th2、Th17、Treg細胞的特征性轉錄因子。
　　6、IL-17對腫瘤細胞凋亡情況研究
　　荷瘤小鼠接種腫瘤細胞后35天，取各組小鼠腫瘤組織，甲醛固定制備蠟塊，切片后TUNEL法檢測各腫瘤組織中凋亡細胞數(shù)量。
　　結果:
　　1、IL-17影響荷瘤小鼠脾細胞亞群分布研究
　　Real-Time PCR法檢測結

7、果顯示，與接種C26、C26/pcDNA3.1的荷瘤小鼠相比，IL-17可以使接種C26/pcDNA3.1-IL-17細胞的荷瘤小鼠脾淋巴細胞中ROR-γt+細胞、IFN-γ+細胞、Th2+細胞和IL-10+細胞細胞增多（P＜0.05），同時IL-17+細胞、T-bet+細胞和Foxp-3+細胞的數(shù)量減少(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1的荷瘤小鼠相比，脾細胞中各細胞因子或轉錄因子mRNA的水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.

8、05)。
　　2、IL-17對腫瘤組織中淋巴細胞浸潤情況研究
　　HE染色結果顯示IL-17可以使小鼠腫瘤組織中淋巴細胞浸潤數(shù)量明顯多于接種C26/pcDNA3.1細胞和C26細胞的小鼠腫瘤組織(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1的小鼠腫瘤組織淋巴細胞浸潤數(shù)量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　3、IL-17對腫瘤組織中血管密度檢測
　　免疫組化結果顯示IL-17可以使小鼠腫瘤組織中CD34+和

9、Nestin+血管數(shù)量多于接種C26/pcDNA3.1細胞和C26細胞的小鼠腫瘤組織(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1的小鼠腫瘤組織血管數(shù)量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4、荷瘤小鼠腫瘤組織中相關細胞因子檢測
　　Real-Time PCR結果顯示接種C26/pcDNA3.1-IL-17細胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織高表達IL-17、IFN-γ、TGF-β

10、和IL-23 mRNA（P＜0.05）;同時IL-17可以使接種C26/pcDNA3.1-IL-17細胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織低表達IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13 mRNA（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織各細胞因子表達情況無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　Western blot法結果顯示接種C26/pcDNA3.1-

11、IL-17細胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織高表達IL-17、IFN-γ蛋白;但是低表達IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IL-13蛋白;接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織各細胞因子表達情況無明顯差異。
　　5、荷瘤小鼠腫瘤組織中Th1，Th2，Th17，Treg細胞特征性轉錄因子的表達情況檢測
　　Real-Time PCR結果顯示接種C26/pcDNA

12、3.1-IL-17細胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織高表達ROR-γt(Th17特征性轉錄因子)和T-bet（Th1特征性轉錄因子）;但是低表達GATA-3（Th2特征性轉錄因子）和Foxp-3（Treg特征性轉錄因子）（P＜0.05）;接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織各轉錄因子表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　Western blot法結果顯示接種C26/pcD

13、NA3.1-IL-17細胞的小鼠腫瘤組織比接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織高表達ROR-γt和T-bet蛋白，同時低表達Foxp-3蛋白;接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織該轉錄因子表達情況無明顯差異。
　　6、IL-17對腫瘤細胞凋亡情況研究
　　TUNEL結果顯示IL-17可以使接種C26/pcDNA3.1-IL-17細胞的小鼠腫瘤組織中凋亡細胞數(shù)量明顯多于接種C26/pcDNA

14、3.1細胞和C26細胞的小鼠腫瘤組織(P＜0.05);接種C26、C26/pcDNA3.1細胞的小鼠腫瘤組織凋亡細胞數(shù)量無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結論:
　　1、IL-17基因轉染可改變小鼠脾淋巴細胞不同亞群的分布。
　　2、IL-17基因轉染可使腫瘤組織中淋巴細胞浸潤數(shù)量增多。
　　3、IL-17基因轉染可使腫瘤組織高表達IFN-γ，但低表達IL-10和IL-13因子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。