超低頻經顱磁刺激對局部腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)內源性神經干細胞的影響.pdf

1、背景：
　　腦血管疾病由于其高患病率、高致死率和高致殘率，是威脅人類健康的一類重要疾病，給社會、家庭帶來了沉重的負擔。傳統(tǒng)的觀點認為中樞神經系統(tǒng)(central never system，CNS)損傷后，神經功能的缺失是永久性的，不能恢復。但大量的研究表明，缺血缺氧損傷后相鄰及遠隔區(qū)域會出現細胞壞死和凋亡，并發(fā)廣泛遲發(fā)性腦缺血伴腦血流量下降;同時也可以激活少量的內源性神經干細胞(neural stem cells，NSCs)，使其

2、發(fā)生增殖、遷移、分化及整合，以修復受損的組織。越來越多的證據表明CNS具有潛在的自我修復能力，主要是因為在側腦室下區(qū)(SVZ)、海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)、大腦皮質、第四腦室和脊髓中央管等部位存在可以向神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞分化的神經干細胞。在多種病變或某些因素刺激下這些NSCs可被激活，增殖后，在某些趨化因子的引導下遷移向損傷部位，并發(fā)生分化與整合，但是新生干細胞的數量和存活時間有限，且主要形成膠質瘢痕，不能良好的修復受

3、損神經組織。不同部位的神經干細胞對不同的病變或損傷，激活情況不同。海馬齒狀回是NSCs主要存在的區(qū)域之一，而且對腦卒中和神經退行性變等神經損傷反應較為敏感，如缺血再灌注損傷未直接作用于海馬，但病理檢查發(fā)現海馬區(qū)明顯的細胞改變，并有明顯的神經再生。腦損傷后，存在較多影響NSCs激活、增殖的因素，如年齡、細胞因子、神經遞質等。巢蛋白(nestin)是原始神經組織表達的一種中間絲結構蛋白，主要定位于細胞質。nestin主要在未分化、具有分裂能

4、力的細胞表達，其表達與干細胞成熟的終末分化過程相一致。因此，我們將nestin視為神經干細胞或神經前提細胞的標志之一，用于NSCs的鑒定。而5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)是一種胸腺嘧啶核苷酸類似物，在細胞增殖周期嵌入細胞核DNA中，從而標記新生細胞，我們將Brdu陽性細胞視為新增殖的細胞。
　　重復經顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)技術是利用電磁感應原

5、理，將脈沖磁場作用于腦部，通過改變刺激頻率使皮層神經細胞的膜電位發(fā)生變化，使之產生感應電流，影響腦內代謝和神經電活動，從而導致CNS變化的磁刺激技術。rTMS被廣泛應用于人類腦生理功能如運動、視覺、語言等和疾病狀態(tài)下腦的病理生理改變等的研究。近年來rTMS在治療腦損傷疾病如帕金森病、抑郁、腦血管疾病等和精神類疾病如抑郁、焦慮、失眠等取得了良好的效果。有研究證實，采用rTMS治療缺血性腦卒中，可明顯改善病人包括精細動作等的運動功能、看圖識

6、物能力、命名能力及語言表達能力。刺激頻率不同，rTMS對CNS的作用不同，高頻(＞1Hz)刺激可以增加局部皮質的興奮性和血流量，相反，低頻(≤1Hz)刺激可以降低皮質興奮性和血流量。rTMS為多脈沖磁場，而超低頻磁刺激(ultra-low-frequency transcranial magneticstimulation，ULF-TMS)刺激頻率＜0.2Hz，為連續(xù)磁場。ULF-TMS可通過干預神經遞質的活性影響腦的功能，具有特殊的生

7、物物理特性及臨床應用價值。隨著ULF-TMS應用領域的不斷拓寬，其治療機制的問題也日益受到人們的重視。目前的許多研究提示rTMS治療CNS疾病可能通過影響NSCs而發(fā)揮作用，如rTMS可促進海馬齒狀回BDNF，5-HT的表達，而BDNF，5-HT則是NSCs的正性調節(jié)因子;rTMS可引起腦內微環(huán)境的變化，而微環(huán)境則是影響NSCs的重要因素。ULF-TMS的連續(xù)磁場可在腦區(qū)產生超低頻電流，進而模擬多種神經遞質的慢突觸后電位的作用。施加的U

8、LF-TMS頻率不同，可分別影響興奮性神經遞質和抑制性神經遞質，1mHzULF-TMS與抑制性神經遞質γ-GABA的活動有關，11 mHzULF-TMS則對應興奮性神經遞質多巴胺(DA)。本實驗比較1mHz、11mHz頻率的ULF-TMS與10Hz的rTMS對NSCs的影響，研究不同頻率的ULF-TMS在不同的時間點對局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經運動功能恢復的作用及對模型大鼠海馬區(qū)內源性神經干細胞激活、增殖的影響。
　　目的：

9、
　　本實驗通過比較2種ULF-TMS與10Hz的rTMS對內源性神經干細胞的影響，研究不同頻率的ULF-TMS在不同的時間點對局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經運動功能恢復的作用以及對模型大鼠海馬區(qū)內源性神經干細胞激活、增殖的影響。
　　方法：
　　1、線栓法制備SD大鼠左側缺血再灌注損傷模型。將造模成功的大鼠隨機分配到1mHz7天組、1mHz14天組、1mHz21天組，11 mHz7天組、11mHz14天組、11mH

10、z21天組，10Hz7天組、10Hz14天組、10Hz21天組及假刺激7天組、假刺激14天組、假刺激21天組;另手術制備假手術組。2、1 mHz組、11mHz組分別給予頻率為1 mHz、11 mHz的ULF-TMS;10Hz組施加頻率為10Hz的rTMS;刺激強度均為500 Gs，每次15 min，1次/d;假刺激組同樣放置磁刺激儀，但不給予磁刺激，余處理同磁刺激組;假手術組自然飼養(yǎng)。3、各組大鼠在處死前24小時腹腔注射Brdu。4、分

11、別在第7天、第14天及第21天應用18分制神經功能障礙評分方法對各組大鼠進行神經功能評定。5、將評分后的模型大鼠處死后取腦，置4％多聚甲醛中后固定過夜，之后石蠟包埋，行連續(xù)冠狀位切片，取切片分別行HE染色及免疫組化SABC法檢測nestin及Brdu的表達水平;Western Blot檢測各組大鼠不同時間點海馬區(qū)nestin蛋白表達水平。
　　統(tǒng)計學方法：
　　膠片用掃描儀將圖像輸入電腦，利用Image-Pro Plus軟件

12、測定免疫組化nestin陽性及BrdU陽性表達的平均光密度;Image-Pro Plus圖像分析軟件測定nestin和內參GAPDH條帶平均灰度值，nestin蛋白相對表達量用兩者的比值表示。應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計數結果均以（(X)±S）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，進一步行兩兩比較（LSD法），以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結果：
　　1、假手術組在不同時間點，神經行

13、為學評分未見明顯變化，且均高于假刺激組及磁刺激組;第7天，神經行為學評分三組磁刺激組與假刺激組無明顯統(tǒng)計學差異;在14天、21天，1 mHz ULF-TMS組、11mHz ULF-TMS組和10Hz rTMS組評分均高于假刺激組;但10Hz組評分較高，與1mHz、11 mHz評分有差異;1mHz與11 mHz相比則無明顯統(tǒng)計學差異。
　　2、磁刺激組及假刺激組大鼠海馬部位均可見到nestin陽性的細胞，陽性物質呈棕黃色，主要沉積在

14、胞漿;在7天、14天、21天，假刺激組nestin平均光密度均高于假手術組;在三個時間點，3組磁刺激組nestin平均光密度較假刺激組明顯增高;但10Hz組與1mHz、11 mHz有差異，其值較高;1mHz與11 mHz相比則無明顯統(tǒng)計學差異。
　　3、Brdu陽性細胞呈棕黃色，陽性物質主要沉積在胞核;不同時間點假手術組Brdu陽性平均光密度明顯低于磁刺激組及假刺激組;在第7天、14天、21天，10Hz組與1mHz組、11 mHz

15、組、假刺激組相比，Brdu陽性平均光密度增多;1mHz組、11 mHz組和假刺激組之間3個時間點均無顯著性差異。
　　4、Western蛋白印跡顯示假手術組nestin蛋白幾乎無表達;10Hz組與1mHz組、11 mHz組nestin蛋白表達均較假刺激組明顯增多;10Hz組表達的nestin蛋白在不同時間點與1 mHz組、11mHz組相比有顯著性差異，10Hz組表達較多;1mHz與11 mHz之間表達差異不明顯。
　　結論：

16、
　　1、1 mHz ULF-TMS、11 mHz ULF-TMS和10Hz的rTMS均可促進局部腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經運動功能的恢復;但在不同時間點，1mHz ULF-TMS、11 mHzULF-TMS與10Hz的rTMS對促進神經運動恢復的程度不同。
　　2、局部腦缺血再灌注損傷可引起模型大鼠海馬區(qū)NSCs的激活和增殖。
　　3、1mHz ULF-TMS、11mHz ULF-TMS和10Hz的rTMS在7天、