宮頸癌患者Treg細胞及其Foxp3基因啟動子區(qū)甲基化水平的研究.pdf

1、近年來，人們發(fā)現(xiàn)Treg細胞對于調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)、維持自身免疫耐受起到至關(guān)重要的作用，其負性免疫調(diào)節(jié)機制及與眾多疾病特別是惡性腫瘤間關(guān)聯(lián)已經(jīng)被大量研究所證實。目前腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域普遍認為，Treg細胞抑制了抗腫瘤免疫功能，促進了惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Treg是一個異質(zhì)性群體，大體可以分為兩個亞群，包括自然產(chǎn)生的Treg細胞(nTreg)和抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg細胞(iTreg)，2種亞群在細胞起源、抗原特異性及調(diào)節(jié)免疫抑制等方面不盡相同，目

2、前認為是iTreg細胞抑制了抗腫瘤免疫，而非nTreg細胞。由于nTreg和iTreg細胞沒有特異性的表型差異，因此目前尚無科學(xué)方法對二者進行區(qū)分。一般認為，在沒有受到抗原刺激的情況下，Treg細胞大多屬于nTreg，如果機體受到抗原刺激時，體內(nèi)nTreg和iTreg則共存。因此，如果可以在腫瘤患者體內(nèi)特異性甄別iTreg細胞與nTreg細胞，靶向去除iTreg細胞或針對性抑制其功能，將為腫瘤免疫治療帶來希望。
　　Treg細胞免

3、疫抑制功能的發(fā)揮依賴于Foxp3分子的表達，F(xiàn)oxp3是轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix（叉頭樣/翼狀螺旋）家族的成員，其編碼基因位于X染色體，F(xiàn)oxp3分子是賦予Treg細胞免疫抑制功能的主要分子。研究發(fā)現(xiàn)，nTreg細胞Foxp3呈持續(xù)而穩(wěn)定的表達，其免疫抑制功能因此能夠穩(wěn)定發(fā)揮，而體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg，其Foxp3表達卻極不穩(wěn)定，可能需要體外培養(yǎng)環(huán)境中多種細胞因子，諸如TGF-β、IL-10、IL-2等的持續(xù)

4、刺激來維持其穩(wěn)定表達。相對于單純的體外研究環(huán)境，實際體內(nèi)免疫環(huán)境要復(fù)雜的多，究竟哪種因素或由幾種因素協(xié)同作用誘導(dǎo)iTreg分化，并進一步調(diào)控Foxp3的表達卻不得而知。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人類Foxp3基因具有高度保守的非編碼區(qū)(conserved noncoding sequence，CNS)，包括啟動子區(qū)及內(nèi)含增強子區(qū)，該區(qū)域富含CpG島，nTreg細胞CpG位點幾乎全部為去甲基化狀態(tài)，而體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg細胞該區(qū)域甲基化程度

5、增高。
　　目的：
　　眾所周知，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了一個漫長過程，同時也是腫瘤免疫失衡的動態(tài)演變過程。Treg細胞在這一進程中處于負性免疫調(diào)控的中心。我們推測，腫瘤患者體內(nèi)的Treg細胞，特別是iTreg細胞的負性免疫調(diào)控可能起到關(guān)鍵作用。本課題組通過采集臨床資料，動態(tài)研究宮頸癌患者Treg細胞Foxp3的表達變化及其啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平，深入了解腫瘤患者體內(nèi)Treg細胞的生物學(xué)特點，為今后的免疫靶向治療提供理

6、論依據(jù)。
　　材料及方法:
　　一、研究對象
　　本實驗獲得解放軍202醫(yī)院臨床倫理委員會批準，所有參加者均被告研究目的，并簽署知情同意書。簡單隨機抽樣分組，隨機選取2013年1月至2014年6月間本院婦科病房收治的早期宮頸癌患者（FIGO分期為Ⅰa2～Ⅱa1期）25例，臨床分期Ⅰa2期5例，Ⅰb1期7例，1b2期8例，Ⅱa1期5例;組織學(xué)類型鱗癌20例，腺癌4例，腺鱗癌1例。HSIL（high-grade squam

7、ous intereapithelial lesion，又稱為宮頸鱗狀上皮內(nèi)高度病變）患者[1]20例，其中宮頸癌患者均采用廣泛性子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)前未行放化療，如術(shù)后需輔助治療，均于術(shù)后一個月進行;HSIL患者采用LEEP局部切除術(shù);同期內(nèi)收集我院行體檢的健康志愿者(TCT及HPV檢測均陰性)10例作為正常健康對照。上述患者和正常對照者平均年齡分別為43.8+4.4歲、44.1±5.0歲39.5±2.7歲，組間無顯著性差異

8、(P＜0.05)，所有研究對象無嚴重感染、結(jié)締組織病、自身免疫病、代謝?。ㄌ悄虿〕猓┖推渌麌乐氐穆约不迹ㄈ缤砥诟斡不?、未經(jīng)治療的甲狀腺功能亢進或減退等），近3個月未行免疫治療。
　　二、主要試劑與儀器
　　主要試劑:eBioscience公司Treg細胞流式檢測試劑盒（鼠抗人CD4-FITC、CD25-APC，F(xiàn)oxp3-PE單克隆抗體）及同型IgG熒光對照;美天旎公司人Treg磁珠分離試劑盒;ZYMO RESEARCH

9、公司DNA甲基化試劑盒;上海生工PCR引物;人TGF-β、IL-10 ELISA試劑盒等。
　　主要儀器:BD公司FACS CantoⅡ型流式細胞儀，PCR儀，RT-PCR儀，自動測序儀，全自動酶標儀，電泳儀（槽），低速離心機，紫外凝膠成像系統(tǒng)等。
　　三、標本采集與檢測方法
　　1、所有受試對象（除外健康自愿者）于術(shù)前及術(shù)后不同時期抽取清晨空腹肘靜脈血8 ml，分別注入EDTA管6ml及非抗凝管2ml，立即置入冰盒送

10、解放軍202醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育實驗室檢測。
　　2、Ficoll密度梯度分離人外周血單個核細胞(PBMC)
　　向2只無菌25ml離心管中加入5ml淋巴細胞分離液;將6ml EDTA抗凝靜脈血液與等量Hanks液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢滴加于分層液面上，注意保持清楚界面;2000rm離心20min，離心管內(nèi)分為三層，在上、中層界面處有一處單核細胞聚集的白色云霧狀窄帶;用毛細管插入此層中吸出單個核細胞;用5倍體積的Hanks洗滌液

11、，上下顛倒混勻，1500rm離心5min，棄上清，再重復(fù)洗滌、離心，最后加入10％胎牛血清RPMI1640，重懸細胞，細胞計數(shù)，添加Hanks平衡液使最終PMBC濃度達到1×107/ml。
　　3、流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞
　　按試劑盒說明操作:取含1×106個新鮮人外周血PMBC懸液各100μl，分為4組:空白對照管、FITC標記的CD4單抗單標對照樣本管、PE標記的CD25單抗單標對照樣本

12、管、PE-Cy5標記的Foxp3單抗單標對照樣本、三標檢測管;加入300μl冷的流式染色緩沖液，充分吹打及4℃避光孵育;開機，10min穩(wěn)定，以前向散射角(FSC)為橫坐標、側(cè)向散射角(SSC)為縱坐標的二維散點圖上，調(diào)整參數(shù)、閾值，排除碎片和噪聲干擾，以CD4設(shè)門，以CD4為橫坐標，SSC為縱坐標，淋巴細胞分為CD4+T細胞和CD4-T細胞，在CD4+T細胞中，以CD25設(shè)門，分析檢測CD4+CD25+ Foxp3+Treg細胞數(shù)量及

13、所占CD4+CD25+Treg細胞比例。
　　4、磁珠分選CD4+CD25+Treg細胞。
　　5、采用ELISA試劑盒檢測TGF-β、IL-10的含量。
　　6、亞硫酸氫鈉修飾的甲基化測序技術(shù)(bisulfite sequencing PCR，BSP)對宮頸癌患者Treg細胞Foxp3基因啟動子區(qū)CpG位點進行甲基化檢測及測序。
　　7、采用RT-PCR技術(shù)檢測Treg細胞內(nèi)甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的表達。<

14、br>　　結(jié)果:
　　1、宮頸癌及HSIL患者分別與對照組比較，外周血中CD4+CD25+Treg/CD4+T及CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例均呈顯著增加(P＜0.05);術(shù)后1周，CD4+CD25+Treg/CD4+T細胞比例無明顯變化，而CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例卻出現(xiàn)顯著降低(P＜0.05);術(shù)后1個月與術(shù)后1周比較，CD4+CD25+Treg/CD4+T比例出現(xiàn)了明顯

15、下降(P＜0.05)，而CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例較術(shù)后1周卻無明顯變化;HSIL與宮頸癌患者之間比較始終無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2、Treg細胞相關(guān)免疫細胞因子TGF-β、IL-10在宮頸癌及HSIL患者血清中表達水平較對照組顯著升高(P＜0.05)，術(shù)后1周及術(shù)后1月，其表達水平又出現(xiàn)顯著性降低(P＜0.05);其表達水平與外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的數(shù)量變化呈正相關(guān)(P＜

16、0.05);而與CD4+CD25+Treg細胞的數(shù)量變化卻未見明顯相關(guān)。
　　3、對宮頸癌及HSIL患者外周血CD4+CD25+Treg細胞Foxp3基因啟動子區(qū)(-204～+12bp)8個CpG位點進行焦硫酸測序發(fā)現(xiàn)，其Foxp3基因啟動子區(qū)（-138，-77，-65）CpG位點甲基化水平較對照組顯著升高(P＜0.05); DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1、DNMT3a) mRNA表達水平亦較對照組明顯升高(P＜0.05);而術(shù)后

17、一個月，DNMT1、DNMT3a表達水平呈顯著下降，較對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。宮頸癌和HSIL患者無論是在甲基化位點、表達水平，還是在甲基化轉(zhuǎn)移酶表達水平方面均無顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1、宮頸癌及HSIL患者外周血Treg細胞Foxp3表達具有不穩(wěn)定性，其表達水平與抑制性細胞因子TGF-β、IL-10表達水平呈正相關(guān)，二者可能共同參與形成了宮頸腫瘤患者體內(nèi)的免疫抑制環(huán)境，為評估腫瘤患者的免疫狀態(tài)，臨床治療效果以及預(yù)后