魚腥藻PCC7120基因all3211-asl3212和asl4561-asl4562的初步研究.pdf

1、毒素-抗毒素系統(tǒng)廣泛存在于原核生物體內,通過系統(tǒng)中一對共表達的基因產物相互作用參與介導外界環(huán)境脅迫條件下細胞生長抑制或死亡的生理活動。目前,只是對于大腸桿菌染色體上毒素-抗毒素系統(tǒng)mazEF和relBE研究相對深入,僅有少量的實驗報導進行藍細菌染色體TA系統(tǒng)的研究。本實驗是首次對魚腥藻PCC7120體內的TA系統(tǒng)同源基因進行探索研究,在生物信息學理論分析的基礎上,借助雙啟動子表達載體可單獨和同時誘導表達的特性,分別控制預測的毒素基因和抗

2、毒素基因表達,分析對細胞生長影響,從而鑒定出目的基因的毒素-抗毒素作用;并且通過基因敲除原理構建缺失突變株,確定目的基因在魚腥藻PCC7120體內生理調節(jié)功能。主要包括以下幾方面內容:
　　1)根據細菌染色體上TA系統(tǒng)基因的遺傳結構特征,保守序列、編碼產物同源性及蛋白等電點等理化性質預測和結構域等二級結構預測初步確定魚腥藻PCC7120染色體上兩對基因:all3211/asl3212為mazEF毒素-抗毒素系統(tǒng)同源基因,asl45

3、61/asl4562為relBE毒素-抗毒素系統(tǒng)同源基因;
　　2)構建雙啟動子誘導表達載體,分別將毒素基因 all3211置于 PBAD啟動子之下、抗毒素基因asl3212置于Plac啟動子之下,誘導表達,鑒定這對mazEF同源基因各自對大腸桿菌細胞的毒素-抗毒素作用:all3211基因在 L-(+)-阿拉伯糖單獨誘導下對大腸桿菌細胞產生毒性,當 L-(+)-阿拉伯糖和 IPTG同時誘導all3211/asl3212基因表達時,

4、可解除all3211表達產物對對大腸桿菌細胞的毒性,證明all3211和asl3212構成一對毒素-抗毒素系統(tǒng),all3211為毒素基因,asl3212為抗毒素基因;
　　3)構建重組表達質粒pET28a-asl4561和pET28a-asl4562,在大腸桿菌中誘導 asl4561和 asl4562表達,鑒定這一對 relBE同源基因的生理功能,并對asl4561-asl4562合基因蛋白表達條件進行優(yōu)化,結果表明:IPTG誘導

5、 asl4561表達產物對大腸桿菌有抑制作用,說明asl4561編碼蛋白產物作用于大腸桿菌生命調節(jié)系統(tǒng),造成損害;兩基因共表達時,對大腸桿菌毒性作用減少,說明兩基因的表達產物發(fā)生相互作用,解除 asl4561表達產物對大腸桿菌的毒性;asl4561-asl4562合基因最佳誘導表達條件為 IPTG濃度0.8 mM、Kan濃度100μg/mL、在接種后培養(yǎng)1-1.5 h后加入誘導劑,28℃誘導6 h;
　　4)用 Kan抗性片段代替

6、 all3211-asl3212或 asl4561-asl4562基因對構建的all3211-asl3212或asl4561-asl4562基因缺失突變株,在常規(guī)培養(yǎng)條件下構建的魚腥藻缺失突變株生長正常,沒有顯著影響細胞生理功能,為進一步深入確定這兩對基因功能機理奠定基礎;
　　5)根據之前在大腸桿菌中實驗結果,將毒素基因和合基因置于銅離子結合蛋白啟動子 PPetE之下,構建銅離子誘導表達載體,轉化魚腥藻 PCC7120 all3

7、211-asl3212和 asl4561-asl4562基因對缺失突變株,銅離子誘導 all3211、asl4561表達產物對魚腥藻 PCC7120細胞具有毒性作用,當銅離子誘導all3211/asl3212、asl4561/asl4562共表達時,毒素蛋白對魚腥藻PCC7120細胞的毒性作用被抑制。并且在不同銅離子濃度培養(yǎng)條件下,隨著銅離子濃度加大,誘導毒素蛋白表達的突變株生長量相應減少,說明毒素蛋白導致大部分藻細胞死亡,一部分藻細胞