低氧通過抑制miR-218激活PERK在低氧性肺動脈高壓中作用研究.pdf

1、肺動脈高壓(PH)是一種涉及多種臨床狀況并會使大多數(shù)心血管及呼吸系統(tǒng)疾病復(fù)雜化的病理生理紊亂。有報導(dǎo)顯示PH患病率為97/百萬人，年齡標(biāo)準(zhǔn)化的死亡率為4.5-12.3/十萬人。低氧性肺動脈高壓(HPH)是由肺部疾病和（或）低氧所致的肺動脈高壓，常見于間質(zhì)性肺疾病及慢性阻塞性肺病，肺部疾病發(fā)展致PH時均伴有運動能力的惡化，低氧加重和生存時間縮短。因此，對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究有重要意義。
　　MicroRNA是一種長度約22nt的小分子

2、非編碼RNA，研究顯示與肺動脈高壓相關(guān)的因素如低氧、炎癥等均可以調(diào)節(jié)microRNA的表達(dá)。近年來，microRNA作為一種上游信號分子在PH肺血管重塑中的作用受到關(guān)注，而且越來越多的研究表明，microRNA有望作為PH治療的新靶點。
　　本課題組通過芯片技術(shù)在HPH大鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)了一批表達(dá)變化的microRNA，從中挑選出了表達(dá)降低的miR-218。在大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)中研究其對PASMCs增殖、遷移、凋亡

3、的影響，并對其進(jìn)行靶基因預(yù)測和驗證。在HPH大鼠模型中特異性抑制miR-218靶基因PERK，檢測抑制PERK對HPH肺動脈壓力及肺血管重塑的影響。本研究為HPH的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路，為HPH的治療提供了新的靶點。
　　第一部分 MicroRNA在低氧性肺動脈高壓大鼠模型肺組織表達(dá)譜分析
　　目的:
　　檢測HPH與常氧對照組大鼠肺組織中差異性表達(dá)的microRNA。
　　方法:
　　首先構(gòu)建HPH大鼠

4、模型，通過右心室壓力測定(RVSP)、右心肥厚指數(shù)(RVHI)計算及HE染色確定HPH模型構(gòu)建是否成功。采用microRNA芯片技術(shù)檢測HPH與常氧對照組大鼠肺組織中microRNA的表達(dá)譜，通過real-time PCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，最后運用生物信息學(xué)方法對芯片結(jié)果進(jìn)行分析，以篩選可能與HPH相關(guān)的microRNA。
　　結(jié)果:
　　1.芯片雜交結(jié)果經(jīng)分析后顯示，有51種microRNA在HPH模型大鼠肺組織中異常表

5、達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的有26個(p＜0.001)，表達(dá)下調(diào)的25個(p＜0.001)。選取5個microRNA: miR-218，miR-26a，miR-34a，miR-98，miR-203進(jìn)行real-timePCR驗證，結(jié)果示real-time PCR中microRNA的變化方向及程度與芯片高度一致;
　　2.GO分析顯示，HPH大鼠肺組織與對照組差異性表達(dá)microRNA的高富集度的靶基因功能包括多種，涉及細(xì)胞的生長、分化、凋亡

6、等。其中上調(diào)microRNA的高富集度靶基因功能包括鈣離子感受、DNA結(jié)合、細(xì)胞器成分等，下調(diào)microRNA的高富集度靶基因功能包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、磷酸酶活性調(diào)節(jié)等。
　　小結(jié):
　　與對照組相比，HPH大鼠肺組織中有26個microRNA表達(dá)上調(diào)，25個microRNA表達(dá)下調(diào)，通過GO分析HPH大鼠肺組織與常氧對照組差異性表達(dá)的microRNA的高富集度靶基因功能涉及細(xì)胞的生長、分化、凋亡。
　　第二部分

7、 MiR-218在低氧處理的大鼠PASMC s中的表達(dá)及其對PASMCs增殖、遷移及凋亡的影響研究
　　目的:
　　檢測miR-218在低氧處理的大鼠PASMCs中的表達(dá)及其對PASMCs增殖、遷移及凋亡的影響。
　　方法:
　　首先用酶聯(lián)合消化法原代培養(yǎng)大鼠PASMCs并鑒定，用real-time PCR檢測低氧處理的PASMCs中miR-218的表達(dá)。在PASMCs中通過轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic和miR

8、-218-Inhibitor分別過表達(dá)和抑制miR-218，轉(zhuǎn)染miR-NC作為陰性對照，分別利用CCK-8和EdU法、劃痕實驗、流式法檢測其對PASMCs增殖、遷移、凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.低氧24h及48h后，PASMCs中miR-218的表達(dá)均顯著低于常氧對照組(P＜0.01);
　　2.相比轉(zhuǎn)染miR-NC組，CCK-8實驗結(jié)果示:轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組OD值顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-218-I

9、nhibitor組OD值顯著升高(P＜0.05);EdU實驗結(jié)果示:轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組增殖期細(xì)胞比例明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-218-Inhibitor組增殖期細(xì)胞比例明顯增高(P＜0.05);劃痕實驗結(jié)果示:轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組轉(zhuǎn)染24h后劃痕寬度明顯大于轉(zhuǎn)染miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-218-Inhibitor組24h后劃痕寬度明顯小于轉(zhuǎn)染miR-NC組(P＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測三組間凋亡細(xì)胞比例，結(jié)果

10、示:3組間細(xì)胞凋亡比例無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　小結(jié):
　　MiR-218在低氧處理的PASMCs中表達(dá)降低，miR-218可以抑制PASMCs的增殖、遷移而不影響其凋亡。
　　第三部分 MiR-218通過抑制PERK在低氧性肺動脈高壓中作用研究
　　目的:
　　預(yù)測miR-218靶基因并進(jìn)行驗證。
　　方法:
　　利用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測miR-218可能的靶基因，在PASMCs中轉(zhuǎn)染

11、miR-218-Mimic，轉(zhuǎn)染miR-NC作為對照，通過熒光定量PCR檢測miR-218可能的靶基因表達(dá)量進(jìn)行初步篩選;在HPH大鼠肺組織中利用Western Blot檢測miR-218可能的靶基因PERK的表達(dá);構(gòu)建pgl-promoter+PERK3'UTR質(zhì)粒，與miR-218-Mimic、Renilla質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，共同轉(zhuǎn)染miR-NC作為對照，利用雙熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic后熒光素酶活

12、性;在PASMCs中轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic，轉(zhuǎn)染miR-NC作為對照，利用Western Blot檢測PERK的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)合文獻(xiàn)篩選miR-218可能的靶基因為PERK、APAK12、TRPC1，熒光定量PCR結(jié)果示PERK在轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic的PASMCs中表達(dá)降低;
　　2.Western Blot結(jié)果示PERK在HPH大鼠肺組織中表達(dá)增高;
　　3.

13、轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic組的熒光素酶活性明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC組，(P＜0.01)。Western Blot結(jié)果示轉(zhuǎn)染miR-218-Mimic的PASMCs中PERK表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染miR-NC組。
　　小結(jié):
　　低氧通過抑制miR-218而激活PERK參與HPH的發(fā)生。
　　第四部分特異性抑制miR-218靶基因PERK對HPH大鼠模型的作用研究
　　目的:
　　檢測miR-218靶基因PER

14、K的特異性抑制劑GSK2656157對HPH大鼠模型的作用。
　　方法:
　　將18只SD大鼠隨機(jī)分為常氧對照組(N-control)、低氧對照組(H-control)、低氧干預(yù)組(H+PERK Inhibitor)，三組大鼠分別經(jīng)過常氧飼養(yǎng)21天、低氧飼養(yǎng)21天、低氧飼養(yǎng)21天+口服PERK抑制劑GSK2656157 bid21天后，經(jīng)頸外靜脈插管測RVSP，留取心臟組織計算RVHI，肺組織經(jīng)福爾馬林固定后，常規(guī)石蠟包埋，

15、HE染色、EVG染色、α-SMA免疫組化，顯微鏡下觀察肺血管重塑情況，計算肺血管重塑指標(biāo)WT％及肌型動脈百分比。
　　結(jié)果:
　　1.H-control組RVSP明顯高于N-control組(38.56±2.67 VS26.20±1.85，P＜0.05)，H+PERK Inhibitor組RVSP明顯低于H-control組（38.56±2.67 VS31.05±2.05，P＜0.05）。H-control組RVHI明顯高于

16、N-control組（0.26±0.02 VS0.4±0.02，P＜0.05），H+PERK Inhibitor組RVHI明顯低于H-control組（0.4±0.02 VS0.31±0.02，P＜0.05）;
　　2.HE染色，與N-control組相比，H-control組肺小血管中膜平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄，管周炎細(xì)胞浸潤，H+PERK Inhibitor組肺小血管中膜平滑肌層增厚不明顯。EVG染色，N-control組肺

17、肌型小動脈具有內(nèi)外雙層彈力纖維及薄的肌肉層，H-control肺肌型動脈中膜平滑肌層顯著增厚，且外層彈力纖維結(jié)構(gòu)顯示不清，H+PERK Inhibitor組肺肌型動脈厚度較H-control組明顯回落，外層彈力纖維結(jié)構(gòu)可見。α-SMA免疫組化，肺肌型動脈中膜平滑肌被染成棕黃色，與N-control組相比，H-control組肺小動脈中膜厚度明顯增加，H+PERK Inhibitor組肺小動脈中膜厚度較H-control組明顯回落;

18、>　　3.H-control組WT％明顯高于N-control組(49.53±5.54％ VS20.08±3.24％，P＜0.01)，H+PERK Inhibitor組WT％明顯低于H-control組（32.47±4.05％ VS49.53±5.54％，P＜0.05）;H-control組肌型小動脈百分比明顯高于N-control組（58.09±6.24％ VS37.76±4.55％，P＜0.01），H+PERK Inhibitor組