RANKL-NFκB-ADAMTS5信號軸調控軟骨退變的機制研究.pdf

1、目的:
　　明確核因子κ B受體活化因子配體(Receptor Activator for NuclearFactor-κ B Ligand，RANKL)對軟骨的直接作用及作用機制，為關節(jié)軟骨退變的治療提供新思路。
　　方法:
　　體外細胞實驗選用軟骨細胞株ATDC5，以明確RANKL對軟骨細胞的直接作用。體外培養(yǎng)采用牛軟骨片，以明確RANKL對軟骨組織的直接作用。體內動物實驗采用C57BL/6J小鼠，以明確RANKL

2、在體內對關節(jié)軟骨的作用。
　　第一部分:RT-PCR檢測正常軟骨細胞中核因子κ B受體活化因子(ReceptorActivator for Nuclear Factor-κ B，RANK)和RANKL的表達，RT-qPCR檢測軟骨細胞ATDC5在分化過程中Col2a1、Col10a、OPG、SOX9、RANK和RANKL的時空表達，Western蛋白印跡檢測RANKL刺激后ATDC5細胞中RANK的表達變化，H&E、Alcian

3、Blue和Safranin0染色及Markin評分分析RANKL刺激對軟骨細胞或組織的直接作用。
　　第二部分: RT-qPCR檢測RANKL刺激后ATDC5細胞Col2a1、MMP9、MMP13、ADAMTS5的時空表達變化，Western蛋白印跡檢測RANKL刺激后MMP13、ADAMTS5的時空表達變化，不同濃度的RANKL刺激對ADAMTS5表達的影響，及RANKL刺激0～120分鐘內總IKB-α和磷酸化的IKB-α的表達

4、變化。免疫熒光和激光共聚焦觀察p65的入核情況。IKB-α特異性抑制劑選用BAY11-7082。RANK沉默選用小干擾RNA。
　　第三部分:Micro-CT檢測關節(jié)腔RANKL后脛骨骨體積分數(shù)的變化，RT-qPCR檢測股骨TRAP、Col2a1和Col10a的表達情況，H&E染色分析關節(jié)軟骨的形態(tài)變化情況，免疫組織化學染色檢測Col2a1、Col10a、MMP9、MMP13、OPG、RANKL和ADAMTS5等蛋白的表達變化。采

5、用SPSS17.0軟件包對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1)軟骨細胞可以表達RANK及RANKL。在軟骨分化過程中，RANKL和RANK的表達隨時間增多。外源性RANKL刺激可以使軟骨細胞的RANK表達上調。外源性的RANKL刺激可導致軟骨結構紊亂，蛋白多糖丟失，Markin評分升高(P＜0.05)
　　2)相對于對照組，RANKL刺激ATDC5細胞后，與軟骨退變相關的MMP9、MMP13和ADAMTS5的表達

6、顯著升高，且有濃度依賴性;而軟骨標志因子Ⅱ型膠原和X型膠原的mRNA水平顯著下降(P＜0.05)。RANKL刺激后細胞中總IKB-α的表達隨時間表達下降，磷酸化IKB-α開始隨時間表達增多，在30min表達達到峰值，隨后下降。免疫熒光染色后，激光共聚焦觀察到p65在30min時有明顯的入核。加入IKB-α特異性抑制劑BAY11-7082后，再次加入RANKL刺激ADAMTS5的表達增量隨著抑制劑濃度增加而下降。RANK沉默后，ADAMT

7、S5的上調也不再觀察到。
　　3)關節(jié)腔內注射RANKL可以引起骨體積分數(shù)下降、Col2a1和Col10a的表達下降及TRAP的表達升高。H&E染色顯示軟骨層空泡的出現(xiàn)及軟骨細胞數(shù)目的減少。免疫組織化學染色顯示，與軟骨標志蛋白Col2a、Col10a的表達下降，而與軟骨退化相關的ADAMTS5、MMP9、MMP13表達升高。與此同時，RANKL表達升高，而OPG的表達下降。
　　結論:
　　RANKL可以通過NFκ B