PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元IRE1α-ASK1通路應答未折疊蛋白反應的分子機制.pdf

1、目的:創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)是因為突發(fā)性的事件或處境而導致的延遲性的精神障礙，病人因為突發(fā)性的災難事件，或者面臨極度令人害怕的場景，出現(xiàn)悲傷、恐懼，導致個人延遲出現(xiàn)精神障礙，而且這種精神障礙會長期持續(xù)存在。
　　PTSD最顯著的特征有:再體驗（重復而且持續(xù)體驗創(chuàng)傷性的事件）;事件回避（逃避回憶及反應麻木）;高喚起（警覺性增高）[1]。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)PTSD

2、的發(fā)病機理有三個方面:皮質(zhì)類醇激素受體功能下降，去甲腎上腺素能和加壓素能系統(tǒng)的興奮，5-HT系統(tǒng)的缺陷[2]。
　　5-HT陽性細胞廣泛分布于中縫核各部，尤以中縫背核部位密集，在情緒調(diào)節(jié)和焦慮行為的病理生理機制中發(fā)揮的重要作用[3]。在PTSD前期研究中，F(xiàn)eifei Luo等發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元5-HT1A受體的表達增高[4]; Dongjuan Liu等從PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元凋亡-線粒體路徑和溶酶體路徑進行了研

3、究，發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元線粒體細胞色素C的釋放增多， TMP（三偏磷酸酶）活性增強，而且中縫背核神經(jīng)元存在凋亡的形態(tài)學改變[5]。由此可見，中縫背核神經(jīng)元的凋亡可能在PTSD的發(fā)病中起重要作用，這可能是大鼠創(chuàng)傷后異常情緒和行為形成的重要病理學基礎之一。
　　據(jù)文獻報道，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導細胞凋亡，是一條新的細胞凋亡信號傳導通路[6～8]，許多疾病的發(fā)病機

4、制都與過度ERS引起的細胞凋亡有關[9～11]。
　　當ERS發(fā)生在細胞時，細胞會啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)應對ERS。參加未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白主要有3個:PRKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)激酶(PRKR-like endoplasmic reticulumkinase，PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6α（activating

5、 transcription factor6，ATF6α）和肌醇需酶1α（inositol requiring kinase1α，IRE1α）[12]。
　　ERS初期細胞主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白誘發(fā)的三個信號通路: PERK通路、IRE1α通路和ATF6通路來重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能[13]。
　　但如果發(fā)生應激反應時間較長，持續(xù)的應激超出了細胞進行UPR的能力，細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無法恢復到正常狀態(tài)的時候， ER

6、S就會導致細胞凋亡。三個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白在過度ERS時誘發(fā)的三個信號傳導通路誘導細胞發(fā)生凋亡的最終通路主要包括CHOP通路和IRE1α-ASK1-JNK通路。
　　在ERS早期，PERK介導的信號通路最先被激活，PERK的激活可迅速減少細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)負荷。如ERS仍然持續(xù)，細胞將進一步激活ATF6α途徑，ATF6α信號通路應答UPR可激活XBP1及上調(diào)蛋白質(zhì)折疊相關酶、分子伴侶，以增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)的處理能力

7、，同時為IRE1激活做好物質(zhì)準備。在PTSD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激ATF6α途徑誘發(fā)細胞凋亡方面，Juhua Xie等發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠中縫背核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF6α、分子伴侶GRP94的表達均明顯升高，提示PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元啟動了UPR，激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF6α通路誘導的細胞凋亡，為進一步從ERS這個角度研究PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元凋亡提供了實驗基礎[14，15]。
　　而若ERS繼續(xù)存在，細胞將啟動IRE1α介導的內(nèi)質(zhì)

8、網(wǎng)應激徑路凋亡，誘導細胞死亡[16]。被激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α可誘導并活化XBP1蛋白的表達[17]。被激活的XBP1蛋白可以激活下游的ERS蛋白，其中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BIP和CHOP(C/EBP homologous protein)，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解相關基因的表達增高，從而激活了UPR和ERS導致的細胞凋亡徑路[18]。
　　PTSD是應激性精神障礙，通常是在遭受到各種巨大災難后而發(fā)病，而這些災難刺激均屬于超強刺激，可導

9、致過度ERS，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)的修飾加工能力大大降低，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的積聚，從而啟動了未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)。
　　那么PTSD大鼠是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α誘導的細胞凋亡信號信號通路呢？LiX等報告PTSD大鼠前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元的IRE1α和XBP1在蛋白和基因水平均表達增高，說明PTSD大鼠發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激IRE1α-XBP1通路誘導的神經(jīng)元凋

10、亡[19]。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，IRE1α的活化一方面能誘導XBP1、CHOP的表達，另一方面，IRE1α還可以結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關因子2(TNF-receptor associated factor2，TRAF2)，形成IRE1α與TRAF2復合體來激活細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosissignal-regulating kinase1，ASK1)[20]?；罨腁SK1能夠通過激活其下游的信號分子JNK和p38，經(jīng)

11、過一系列級聯(lián)反應傳遞信號，促使細胞凋亡[21]。
　　目前，在PTSD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激IRE1α-ASK1信號通路引起神經(jīng)元凋亡方面，尚未見報道。
　　本研究將研究目標集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激IRE1α-ASK1通路應答UPR，誘發(fā)中縫背核神經(jīng)元凋亡的信號通路上，從蛋白和基因水平上觀察PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元IRE1α、ASK1及其下游信號分子JNK、P38、CHOP、Bcl-2、Bax表達量變化，從中找出預防和有效治療PTSD的藥

12、物新靶點。
　　研究方法:
　　采用國際上公認的的單一延長應激(single-prolonged stress，SPS)的方法建立PTSD大鼠模型[22]，隨機分為5組:正常對照組、SPS刺激后1天組、SPS刺激后4天組、SPS刺激后7天組和SPS刺激后14天組;
　　采用Monies水迷宮測試SPS刺激后大鼠的空間記憶和學習能力的表現(xiàn)，包括定位航行實驗和空間探索實驗兩部分。
　　采用免疫組化、Western b

13、lotting及RT-PCR檢測正常對照組和模型組大鼠IRE1α、ASK1和JNK蛋白表達及mRNA分子水平表達;
　　采用免疫組化、Western blotting及RT-PCR檢測正常對照組和模型組大鼠P38、CHOP蛋白表達及mRNA分子水平表達;
　　采用Western blotting及RT-PCR檢測正常對照組和模型組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達及mRNA分子水平表達。
　　結(jié)果:
　　1、PTSD

14、大鼠行為學改變
　　Morries水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著高于正常對照組，同時空間探索實驗中模型組大鼠在目標象限停留的時間百分比明顯低于正常對照組。
　　2、PTSD中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激IRE1α-ASK1-JNK通路誘導細胞凋亡的分子機制研究
　　2.1免疫組織化學技術檢測IRE1α表達
　　免疫組織化學染色結(jié)果顯示:IRE1α的陽性表達主要分布于中縫背核神經(jīng)元核周質(zhì)，陽性信

15、號呈棕黃色顆粒。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，經(jīng)SPS刺激后第1d，與正常對照組比較，IRE1α陽性表達稍有增多，第4d和7d表達量最高(P＜0.01)，隨后第14天表達量顯著下降(P＜0.01);第4d和7d表達量差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.2 Western blotting檢測IRE1α、ASK1和JNK蛋白表達
　　在SPS刺激后，IRE1α的蛋白表達，與正常對照組比較，明顯升高，于7天達到峰值，隨后下降;AS

16、K1、JNK的蛋白表達量，與正常對照組比較，明顯升高，于4天達到峰值，隨后下降。
　　2.3 RT-PCR檢測結(jié)果IRE1α、ASK1和JNK的mRNA表達
　　在SPS刺激后，IRE1α的mRNA表達，與正常對照組比較，明顯升高，于7天達到峰值，隨后下降;ASK1、JNK的mRNA表達量，與正常對照組比較，明顯升高，于4天達到峰值，隨后下降。
　　3、PTSD中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激IRE1α-ASK1-P38通路誘

17、導細胞凋亡的分子機制研究
　　3.1 Western blotting檢測P38、CHOP蛋白表達
　　P38的蛋白表達量，與正常對照組比較，也明顯升高，于1天達到峰值，隨后下降;CHOP的蛋白表達量，與正常對照組比較，明顯升高，于4天達到峰值，隨后下降。
　　3.2 RT-PCR檢測結(jié)果P38、CHOP的mRNA表達
　　在SPS刺激后，P38的mRNA表達量，與正常對照組比較，明顯升高，于4天達到峰值，隨后下

18、降;CHOP的mRNA表達，與正常對照組比較，明顯升高，于第7天達到峰值，隨后下降。
　　4、Bcl-2、Bax因子與PTSD中縫背核神經(jīng)元凋亡的相關性研究
　　4.1 Western blotting檢測Bcl-2、Bax的蛋白表達
　　Bcl-2和Bax的蛋白表達量，與正常對照組比較，也呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢，但是Bcl-2蛋白表達峰值出現(xiàn)較早，在SPS1天即達到，隨后表達量下降，維持在穩(wěn)定水平，而Bax蛋白表達

19、量，與正常對照組比較，在SPS刺激的早期（1-3天），無明顯變化，于SPS刺激4天后明顯升高，維持在較高水平。
　　4.2 RT-PCR檢測結(jié)果Bcl-2、Bax的mRNA表達
　　Bcl-2和Bax的mRNA表達量，與正常對照組比較，也呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢，但是Bcl-2 mRNA表達峰值出現(xiàn)較早，在SPS1天即達到，隨后表達量下降，維持在穩(wěn)定水平，而Bax的mRNA表達量，與正常對照組比較，在SPS刺激的早期（1-3

20、天），無明顯變化，于SPS刺激7天后明顯升高，維持在較高水平。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)SPS刺激后，PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元的IRE1α-ASK1-JNK細胞凋亡信號通路被明顯激活，誘發(fā)了下游的級聯(lián)反應，導致了中縫背核神經(jīng)元的凋亡。
　　2、經(jīng)SPS刺激后，PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元的IRE1α-ASK1-P38細胞凋亡信號通路被明顯激活，誘發(fā)了下游的級聯(lián)反應，導致了中縫背核神經(jīng)元的凋亡。
　　3、在SPS刺激