cTnI抗體結合心肌細胞膜α-enolase激活PTEN-Akt信號通路致心功能損害.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 研究目標為跟蹤評價AMI患者中cTnⅠAAb和左室重構之間的關系，并獲取發(fā)生左室重構的cTnⅠAAb陽性AMI患者血清，以期得到最可能導致AMI患者心臟左室重構的cTnⅠAAb，為后續(xù)實驗研究cTnⅠAAb的功能奠定基礎。在本研究中有131名AMI患者納入研究?；颊哐鍢颖救坎捎瞄g接酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測cTnⅠAAb，患者在入院和出院1年左右檢測超聲心動圖評估左室重構。結果顯示，1

2、31名AMI患者中cTnⅠAAb陽性率為17.56％(23/131)。131名AMI患者中有90人[19（cTnⅠAAb陽性）VS79（cTnⅠAAb陰性））跟蹤到了心臟超聲波數(shù)據(jù)，且19名AMI患者發(fā)生了左室重構。經(jīng)過兩分類Logistic回歸分析，有2個變量為AMI患者左室重構的潛在危險因素，分別是BNP峰值(OR:1.001，95％CI:1.000-1.002，p:0.028)、cTnⅠAAb(OR:3.552，95％CI:1.1

3、48-10.989，p:0.028)。19名發(fā)生了左室重構的AMI患者中有10名cTnⅠAAb陽性和9名cTnⅠAAb陰性。這10名發(fā)生了左室重構的cTnⅠAAb陽性患者血清，可供后續(xù)研究使用。
　　第二部分 研究目標為從第一部分研究中獲得的cTnⅠAAb陽性AMI患者血清中純化出cTnⅠAAb，并證實其可與cTnⅠ特異性結合。在本部分實驗中我們首次報道:從cTnⅠAAb陽性AMI患者中獲得了約36ml患者血清，并成功地純化出2.

4、24mg(0.8ml，2.8mg/ml)cTnⅠAAb。采用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分離該純化蛋白的條帶主要在20KD和50KD附近，與免疫球蛋白相吻合;采用間接免疫熒光、間接免疫組化和Western Blotting技術證實，純化的cTnⅠAAb可以特異性識別人、大鼠、小鼠心肌組織中cTnⅠ，還可與大鼠乳鼠心肌細胞膜的某個蛋白相結合。由于本部分研究獲得的cTnⅠAAb是從10名cTnⅠAAb陽性且發(fā)生左室重構的AMI患者血清中

5、提取的，結合文獻報道cTnⅠAAb與AMI預后差和心功能障礙有關，我們推測純化的cTnⅠAAb也與這些患者LEDV明顯增加有關，是具有致病理作用的。但是這需要更明確的實驗數(shù)據(jù)加以證實。
　　第三部分 研究目標為采用體外實驗的策略，模擬cTnⅠAA與心肌細胞直接接觸的微環(huán)境，重點研究純化的人cTnⅠAAb與原代SD大鼠乳鼠心肌細胞共培養(yǎng)后，心肌細胞出現(xiàn)肥大、凋亡和自噬狀態(tài)的變化，以驗證我們的科學假設。本部分研究結果顯示:將cTnⅠA

6、Ab與心肌細胞共培養(yǎng)12h后，出現(xiàn)了自噬相關基因Atg5和Beclin-1mRNA表達顯著上調(diào)，自噬相關蛋白LC3和Beclin-1表達亦增高，而在24h后這些基因和蛋白的表達都顯著下調(diào)。心肌細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達則在與cTnⅠAAb共培養(yǎng)24h后開始出現(xiàn)變化，48h則更為明顯;隨共培養(yǎng)時間增加促凋亡蛋白Bax表達逐漸增加，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達則逐漸減少。整個過程中，心肌細胞出現(xiàn)自噬和凋亡此消彼長的平衡關系;同批

7、實驗、相同劑量的cTnTpAb對照和人IgG對照則無這些變化。但是在本部分實驗中并沒有觀察到cTnⅠAAb與原代大鼠乳鼠心肌細胞共孵育后致使心肌細胞出現(xiàn)肥大改變。從這些實驗結果得到提示:加入cTnⅠAAb對于培養(yǎng)的原代心肌細胞是一種有害的刺激因素，心肌細胞首先表現(xiàn)出與自噬激活相關的基因mRNA和這些基因編碼的蛋白質表達上調(diào)，自噬激活進行自我保護;當有害刺激因素持續(xù)存在的情況下，自噬的激活逐漸減弱，細胞的凋亡開始增加，但是并未出現(xiàn)代償性心

8、肌細胞肥大或肥大的趨勢。
　　第四部分 研究目標為克服從患者血清中獲得的人cTnⅠAAb量有限的困難，選擇一株能替代cTnⅠAAb的cTnⅠmAb完成后續(xù)研究。明確實驗室自制的3株cTnⅠmAb（cTnⅠmAb N1，cTnⅠmAb N2，cTnⅠmAb N3）所針對cTnⅠ的抗原位點位于何部位，其針對的抗原位點是否為人cTnⅠAAb所針對的主要cTrⅠ抗原位點之一，能否與心肌細胞膜呈現(xiàn)結合，以及結合的細胞膜靶抗原是什么。本部分研

9、究結果顯示:采用抗原位點競爭結合的方法，發(fā)現(xiàn)cTnⅠmAb N1可以與cTnⅠAAb競爭結合BCG823和原代乳鼠心肌細胞膜，致使cTnⅠAAb與心肌細胞膜的結合率顯著下降，并首次證實cTnⅠAAb針對的抗原位點主要為cTnⅠN端a.a.r.26-49，是cTnⅠAAb針對的抗原位點中最主要的、且比例高的之一;采用cTnⅠmAbN1耦聯(lián)的親和層析柱純化出異常表達在BCG823細胞中與之結合的蛋白分子，并通過飛行質譜技術、免疫共沉淀和We

10、stem Blotting技術等，首次明確證實該蛋白分子為α-enolase(ENO1)，而不是cTnⅠ，且cTnⅠmAbN1可以與天然狀態(tài)的α-enolase發(fā)生特異性結合。
　　第五部分 研究目標為明確cTnⅠmAb N1能否重現(xiàn)cTnⅠAAb致心肌細胞病理變化作用？既然cTnⅠmAb可以識別心肌細胞膜表達的ENO1，cTnⅠmAb與心肌細胞共培養(yǎng)后，ENO1的表達發(fā)生了什么變化？這些變化是否與心肌細胞的病理改變相關？本部分研

11、究結果顯示:我們成功地將cTnⅠmAb N1替代了從AMI患者血清中提取的cTnⅠAAb，在原代大鼠乳鼠心肌細胞誘導出濃度依賴的和時間依賴的凋亡應答。同時，在cTnⅠmAbN1刺激心肌細胞的過程中，ENO1的表達明顯升高;采用ENO1-si-RNA抑制ENO1表達后，可以抵抗cTnⅠmAbN1刺激誘導的心肌細胞凋亡;而等濃度的小鼠IgG對照、cTnTmAb4T19抗體對照及Negative-siRNA對照均無此現(xiàn)象。本部分研究結果提示我

12、們，AMI血清中的cTnⅠAAb與心肌細胞作用所引起的心肌細胞凋亡損害，不僅與cTnⅠAAb中與心肌細胞膜結合的抗原位點是否占優(yōu)勢地位有關，也與cTnⅠAAb在患者循環(huán)中的濃度和持續(xù)的時間有關。
　　第六部分 研究目標為使用cTnⅠmAb N1替代cTnⅠAAb，嘗試在動物體內(nèi)引起心臟功能障礙和心肌組織的病理改變，并研究其相關的信號通路，旨在能夠較確切地闡明cTnⅠAAb或cTnⅠmAb N1致心肌損傷的作用和機制，以解釋臨床中所

13、發(fā)現(xiàn)的部分cTnⅠAAb陽性患者出現(xiàn)不良臨床轉歸的可能原因，希望本部分的研究結果能豐富自身免疫性心臟疾病免疫病理損傷的發(fā)生機制，有助于尋找預防和治療AMI后心室重構的新靶標和新策略。本部分結果顯示:采用cTnⅠmAbN1可成功誘導Balb/c小鼠心臟收縮功能障礙，HE染色、masson染色和Tunel染色結果顯示，小鼠心肌組織心肌膠原沉積增加、心外膜鈣化斑塊形成和心肌細胞凋亡輕度增加，而心臟外形和心肌組織細胞大小未見增加，這些實驗結果與

14、第三部分實驗中cTnⅠAAb作用的原代乳鼠心肌細胞出現(xiàn)凋亡增加，而未出現(xiàn)心肌細胞肥大的研究結果互相印證;采用CD3、CD8、CD4、CD20、CD68對模型小鼠心肌組織進行免疫組織化學染色，未見這些免疫分子表達，表明注射cTnⅠmAb N1的Ⅰ組小鼠心臟出現(xiàn)的功能和病理改變主要是代償性的，而非炎性的;采用PathScan Akt Signaling Antibody Array蛋白芯片對小鼠心肌組織Akt通路16個主要磷酸化蛋白位點進行

15、篩查，發(fā)現(xiàn)注射cTnⅠmAbN1的Ⅰ組小鼠心臟組織出現(xiàn)了第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted onchromosome ten，PTEN)Ser380上調(diào)和蛋白激酶B(protein kinases B，Akt)Thr308下調(diào)，而既有文獻證實PTEN缺失與心肌細胞肥大相關，這與前期心肌細胞肥大陰性的結果相互印證;當用cTnⅠmAb N1與原代心肌細胞共

16、培養(yǎng)后，也出現(xiàn)了同樣的信號分子改變，在原代心肌細胞中采用si-RNA沉默心肌細胞內(nèi)的ENO1后，PTEN-Akt信號通路激活的現(xiàn)象減弱，與前期沉默心肌細胞ENO1后心肌細胞凋亡現(xiàn)象得到緩解相互呼應。
　　總之，通過這六部分的實驗結果，我們首次明確證實，cTnⅠAAb不僅是AMI患者發(fā)生心肌損傷后心室重構的獨立危險因素之一，而且從發(fā)生左室重構的cTnⅠAAb陽性AMI患者血清中純化得到的cTrⅠAAb中，針對cTnⅠ的N端a.a.r

17、.26-49位的cTnⅠmAb N1是其主要組成部分。該cTnⅠmAb N1可以通過與心肌細胞膜的α-enolase發(fā)生交叉反應而結合在心肌細胞膜上，引起心肌細胞α-enolase表達升高、PTEN-Akt信號通路激活，PTEN Ser380磷酸化增強，Akt Thr308位磷酸化減弱，最后引起的心肌細胞的改變并不是細胞肥大，而是導致了心肌細胞出現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性的凋亡增加;當采用si-RNA技術沉默心肌細胞的α-enolase，