MLL2促進肺癌A549細胞發(fā)生發(fā)展中的作用機制及蘿卜籽素抑制肺癌A549細胞的生物信息學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　肺癌對人類健康和生活造成巨大危害，并且肺癌五年生存率不到15％，是人類因癌癥死亡的主要原因。許多致癌物質(zhì)都可以通過癌基因和抑癌基因的激活或抑制促使活細胞轉(zhuǎn)化為癌癥細胞。MLL2存在于各種上皮細胞和組織的癌細胞中，如前列腺癌，結(jié)腸癌，肺癌和肝癌中被發(fā)現(xiàn)。因為這些腫瘤細胞中MLL2基因啟動子的CpG島的甲基化顯著增加，因此它被認為是一種腫瘤基因。本研究主要針對MLL2對肺癌細胞的影響進行研究，討論了MLL2基因誘導(dǎo)人肺腺癌

2、 A549細胞增殖，遷移和侵襲的可能機制，研究了肺癌 MLL2基因?qū)M蛋白H3和H4賴氨酸殘基甲基化的影響，最后通過生物信息學(xué)方法分析了可能的相關(guān)基因與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　方法：
　　1、從構(gòu)建過表達和基因沉默 MLL2的 A549肺癌細胞出發(fā)，研究這兩種A549肺癌細胞的生物學(xué)行為的影響。
　　2、通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有MLL2基因的質(zhì)粒，RT-PCR法，WesternBlot，CCK-8細胞測定蛋白表達、以及A549肺

3、癌細胞增殖和集落形成。
　　3、采用熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測MLL2，MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）， PKR（雙鏈RNA依賴性蛋白激酶）的mRNA表達，Western Blot檢測PKR、MLL2和MMP-2的表達；用Transwell小室進行遷移和侵襲實驗檢測A549細胞增殖。
　　4、過表達和沉默MLL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肺腺癌A549細胞，采用Western Blot和免疫熒光試驗檢測 MLL2對 H3K4me

4、3，H3k4me2，H3k4me1，H3K9me3， H3k9me2，H3k9me1，H3k27me3，H3k27me2，H3k27me1，H3k36me3，H3k36me2， H3k36me1，H4k20me3的甲基化狀態(tài)的作用。
　　5、采用R/Bioconductor分析和挖掘基因芯片的數(shù)據(jù)。下載GEO中包含經(jīng)過蘿卜籽素處理前后的A549肺癌細胞的原始數(shù)據(jù)，然后進行標(biāo)準(zhǔn)化處理、質(zhì)控、差異基因的篩選與分析、GO分析、聚類以及通

5、路總結(jié)，進一步的分析基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及分子相互作用。
　　結(jié)果：
　　我們成功構(gòu)建了過表達MLL2的A549肺癌細胞，通過MTT法檢測，發(fā)現(xiàn)該細胞過度表達MLL2基因，與空載體組和對照組相比，過表達MLL2的細胞侵襲遷移顯著增加，同類細胞之間粘附降低，異質(zhì)細胞粘附則增強了，而且擴散加速和集落形成率均發(fā)生了提高。此外，MLL2促使MMP-2 mRNA表達顯著增加；P-PKR蛋白的表達則降低；PKR mRNA的表達與對照組和空載體

6、組相比無顯著差異。
　　Western Blot分析表明，MLL2造成H3K9me3的表達削弱，而沉默MLL2增強H3K9me3的表達， H3組蛋白20位點和H4組蛋白4、27、36位點的甲基化狀態(tài)則沒有顯著差異。免疫熒光表明MLL2造成H3K9me3表達增強，并且與Western Blot結(jié)果一致。
　　最后，通過生物信息學(xué)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了經(jīng)過蘿卜籽素處理前后A549肺癌細胞與MLL2相關(guān)的癌基因發(fā)生了下調(diào)。