MiR-200a與膽道閉鎖患兒肝纖維化的相關(guān)研究.pdf

1、膽道閉鎖（biliary atresia, BA）為嬰幼兒時(shí)期一種以肝內(nèi)外膽管炎癥和纖維化梗阻為特征的嚴(yán)重性肝病，是新生兒期阻塞性黃疸的常見(jiàn)原因，亦是兒童肝移植的首列疾病。該病發(fā)病率為活產(chǎn)兒的1/19000～1/5000，具有區(qū)域差異，以中國(guó)、日本等亞洲地區(qū)多見(jiàn)。異常迅猛的肝纖維化進(jìn)程可使患兒在出生后短短幾周內(nèi)就發(fā)展為肝硬化，未經(jīng)治療的患兒常在2歲以內(nèi)死于肝衰竭。肝門(mén)空腸吻合術(shù)(Kasai術(shù))是臨床上僅有的有效治療方法，然而Kasai術(shù)

2、頂多是延長(zhǎng)患兒自體肝生存時(shí)間、等待肝移植的姑息方法，而不能解除根本的致病因素。即使成功的Kasai術(shù)也未能阻止患兒進(jìn)行性的肝纖維化病變，70％～80%的患兒最后仍需要進(jìn)行肝移植。BA肝纖維化發(fā)展快速，導(dǎo)致預(yù)后較差。而B(niǎo)A的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚，BA快速肝纖維化的機(jī)制也尚未闡明。
　　大量研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）通過(guò)負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)而在不同疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miR-106b在慢性乙型

3、肝炎相關(guān)的肝硬化患者血漿中水平下降，而miR-181b水平上升。血漿miR-20a與丙肝引起的肝纖維化進(jìn)展正相關(guān)，而miR-92a與丙肝引起的肝纖維化進(jìn)展負(fù)相關(guān)。在前期研究中，本課題組通過(guò)二代高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了BA患兒血漿中miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-200a在BA血漿中的表達(dá)比正常對(duì)照組顯著升高。miR-200a在多種器官纖維化中存在異常表達(dá)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， E

4、MT）被證實(shí)在器官纖維化中起著關(guān)鍵作用，而許多研究表明miR-200a能抑制EMT過(guò)程。本研究通過(guò)檢測(cè)BA患兒肝組織miR-200a及EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討miR-200a及EMT通路在BA肝纖維化中的作用。
　　目的:
　　探討miR-200a及EMT通路在膽道閉鎖肝纖維化過(guò)程中的作用，為闡明疾病的發(fā)病機(jī)制及尋找治療靶標(biāo)提供線索。
　　方法:
　　1.以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)BA患兒、正常對(duì)

5、照組與疾病對(duì)照組血漿miR-200a的相對(duì)表達(dá)量，研究BA患兒循環(huán)miR-200a水平與肝纖維化程度及血纖維化指標(biāo)（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與血小板比值，APRI)、肝生化參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果以2-ΔΔCt表示，中位數(shù)（P25，P75）描述。
　　2.患兒肝組織以HE及Masson染色，根據(jù)Ishak系統(tǒng)對(duì)BA肝組織進(jìn)行肝纖維化及炎癥評(píng)分。將BA肝組織標(biāo)本評(píng)分為1、2、3的視為低纖維化組，評(píng)分為4、5、6的歸為高纖維化組；將肝組織炎癥評(píng)分<

6、10的視為輕度炎癥組，評(píng)分≥10的合為重度炎癥組。
　　3.采用酪胺信號(hào)放大熒光原位雜交技術(shù)(TSA-FISH)原位示蹤miR-200a在BA患兒肝組織中的分布情況，并比較高、低纖維化組患兒間及輕、重度炎癥組患兒間miR-200a表達(dá)差異，分析miR-200a與BA肝纖維化及炎癥的相關(guān)性。熒光強(qiáng)度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　4.同時(shí)采用免疫組化檢測(cè)EMT通路中的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白1（ZEB1）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、

7、α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）在BA患兒和正常對(duì)照組肝組織中的表達(dá)情況，研究miR-200a與ZEB1通路相關(guān)蛋白的關(guān)系。結(jié)果以陽(yáng)性染色面積百分比表示，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)描述。
　　結(jié)果:
　　1. BA組、疾病對(duì)照組和正常對(duì)照組血漿miR-200a相對(duì)含量分別為2.95（1.63，7.23）、2.33（1.33，5.68）、1.35（0.42，2.20）。BA組血漿miR-200a水平顯著高于正常對(duì)照組（u=38.50，

8、P<0.01），但與疾病對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（u=97.00， P>0.05）。BA患兒血漿miR-200a水平與肝纖維化分級(jí)無(wú)顯著相關(guān)（r=﹣0.66， P>0.05），低纖維化組與高纖維化組間亦無(wú)明顯差別（u=54.50，P>0.05）。BA患兒血漿miR-200a水平高低與APRI值及肝生化指標(biāo)值（TB、DB、ALP、γ-GT、ALT、AST）亦無(wú)明顯關(guān)聯(lián)（P>0.05）。
　　2.肝組織TSA-FISH結(jié)果顯示BA肝實(shí)質(zhì)區(qū)m

9、iR-200a表達(dá)豐富，匯管區(qū)及纖維間隔則較低。BA組肝組織miR-200a熒光強(qiáng)度顯著高于正常組（11.92±2.18 vs4.33±1.26，t=7.82，P<0.01）。BA患兒中，低纖維化組miR-200a熒光強(qiáng)度則明顯低于高纖維化組（10.89±1.90 vs13.37±1.78，t=﹣2.29，P<0.05），亦即是肝纖維化程度越高，肝組織miR-200a表達(dá)越高，肝組織miR-200a與肝纖維化程度正相關(guān)（r=0.90，P

10、<0.05）；而輕度炎癥患兒與重度炎癥組miR-200a表達(dá)水平分別為11.54±2.70、12.45±1.25，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=﹣0.70，P>0.05），肝組織miR-200a與肝臟炎癥無(wú)明顯相關(guān)（r=0.41，P>0.05）。
　　3.與正常對(duì)照相較，BA患兒肝組織中ZEB1蛋白表達(dá)豐度顯著增高（2.40%vs0.16%， u=0.00， P<0.01），α-SMA蛋白亦明顯增高（12.19%±10.43% vs0.6

11、3%±0.23%，t=2.67，P<0.05），但E-cadherin蛋白則顯示為降低（9.54%±6.72%vs16.80%±6.16%，t=﹣2.22，P<0.05）。BA患兒中高纖維化組與低纖維化組比較，ZEB1蛋白顯著降低（0.74%vs3.62%，u=4.00，P<0.05），而α-SMA蛋白增高（23.73%vs3.93%，u=2.00，P<0.05），E-cadherin也明顯增高（15.17%vs3.80%， u=4.0

12、0，P<0.05）。相關(guān)分析結(jié)果表明，BA患兒肝組織miR-200a表達(dá)與ZEB1蛋白負(fù)相關(guān)（r=﹣0.83，P<0.01），并與E-cadherin蛋白正相關(guān)（r=0.59，P<0.05），但與α-SMA蛋白無(wú)明顯關(guān)聯(lián)（r=0.39，P>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1. BA患兒循環(huán)miR-200a水平雖然不能直接預(yù)測(cè)肝纖維化程度，但可能與BA膽汁淤積引起的肝臟病理改變有關(guān)。
　　2. BA患兒肝組織miR-200