MicroRNA-17~92簇和MicroRNA-221在移植靜脈再狹窄中作用機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　冠狀動脈旁路移植術（Coronary artery bypass grafting，CABG）是缺血心肌血運重建的重要手段，是目前治療冠心病的常用和有效方法。大隱靜脈是 CABG最常用的血管移植材料之一，其臨床使用率超過70%，然而長期的隨訪結果顯示CABG術后1年近15%-25%的橋靜脈血管出現狹窄，術后10年再狹窄率超過50%。移植靜脈再狹窄是心血管外科領域尚未解決的重要臨床問題，且目前尚無有效的防治措施，而基

2、因治療用于防治移植靜脈術后再狹窄具有很好的可行性和安全性，具有廣闊的應用前景。研究表明血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）表型轉化、過度增殖、遷移到內膜及產生的細胞外基質堆積是移植靜脈術后再狹窄發(fā)生的主要病理機制。近年來的研究發(fā)現，microRNA參與了心血管病領域很多重要的生理和病理過程，也是調控 VSMC生物學功能的重要因子。miR-17~92簇是調控細胞增殖和分化的重要 microR

3、NA之一，在多種腫瘤研究中，miR-17~92簇是腫瘤細胞增殖、遷移及凋亡的重要調控因子。此外，miR-221也是調控VSMC的促增殖、促遷移和抗凋亡的關鍵因子，通過調控靶基因p27(Kip1)和p57(Kip2)的下調從而促進VSMC的增殖和表型轉換。
　　研究目的:
　　本課題擬通過構建移植靜脈術后再狹窄動物模型和VSMC增殖細胞模型明確miR-17~92簇是否參與VSMC表型轉化和增殖遷移的調控，及其在移植靜脈術后內膜

4、增生形成中的作用機制。為了充分驗證miRNA Sponge技術在移植靜脈再狹窄基因治療中的有效性和安全性，通過構建 miR-221-Sponge進一步明確是否可以有效抑制移植靜脈術后再狹窄的發(fā)生。
　　研究方法:
　　構建大鼠移植靜脈再狹窄模型，應用microRNA芯片篩選出與移植靜脈再狹窄發(fā)生密切相關的miRNAs，并通過qRT-PCR驗證。構建靜止型和去分化型VSMC模型，檢測細胞表型轉化及miR-17~92前體表達情況

5、。構建miRNA-17~92過表達和沉默腺病毒表達載體，應用qRT-PCR、Western-blot和免疫熒光技術檢測VSMC細胞表型轉化，細胞計數和Brdu法檢測細胞增殖，劃痕和Transwell實驗檢測細胞遷移能力。應用數據庫分析和細胞實驗初步驗證miR-17~92簇調控的可能潛在靶基因。應用miRNA Sponge技術敲除移植靜脈中miR-17~92和miR-221的表達，通過Poloxamer-407-胰蛋白酶混合凝膠經血管外膜

6、途徑局部轉染移植靜脈，術后通過彩超評估移植靜脈吻合口血流動力學情況，進行HE染色測定移植靜脈內膜增生情況，免疫組織化測定橋靜脈中VSMC增生情況，免疫熒光染色分析移植靜脈中VSMC表型轉化情況。
　　研究結果:
　　應用microRNA芯片技術和 qRT-PCR檢測驗證發(fā)現，miRNA-17~92簇的6個成員（miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b，and miR-92a）在移植靜脈組織

7、中相對正常靜脈組織均表達上調。miR-17~92前體在VSMC增殖模型中表達水平增高，并對PDGF的刺激具有時間和濃度依賴性。通過 miRNA Sponge抑制技術沉默miR-17~92的表達可顯著抑制 VSMC的增殖和遷移能力，同時增加VSMC收縮型特異性蛋白如SMA、Calponin和SM-MHC的表達。經初步分析驗證，PTEN可能是miR-17~92簇介導轉錄后調控的重要潛在靶基因之一。動物實驗結果顯示，通過腺病毒介導的miR-1

8、7~92簇Sponge和miR-221 Sponge局部基因治療，可有效抑制移植靜脈術后內膜增生和 VSMC增殖和表型轉換，有效改善移植靜脈術后吻合口血流動力學指標，且并未增加移植靜脈術后炎癥反應的程度。
　　結論:
　　miR-17~92簇是參與VSMC增殖、遷移和表型轉換的重要的調控因子，在轉錄后水平通過調控靶基因PTEN促進VSMC增殖和遷移。應用miRNA Sponge技術靶向沉默miR-17~92簇和miR-221