rTMP-GH融合蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與純化及其促血小板生成作用研究.pdf

1、血小板減少癥在臨床上較為常見，目前用于救治血小板減少癥的藥物不僅種類少，而且還存在各種缺點(diǎn)，臨床上急需新型、高效升血小板藥物。巨核細(xì)胞是血小板生成的前體細(xì)胞，調(diào)控巨核細(xì)胞的增殖與分化是促進(jìn)血小板生成的最有效手段1。 血小板生成素(thrombopoietin，TPO)又稱巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子(MGDF)或血小板生長(zhǎng)因子(TSF)，是巨核細(xì)胞-血小板系統(tǒng)最重要的調(diào)控因子和促進(jìn)血小板生成最主要的細(xì)胞因子。TPO通過(guò)與其受體c-Mp

2、1結(jié)合而刺激巨核細(xì)胞的增殖與分化，并促進(jìn)血小板的生成和釋放，控制循環(huán)血中血小板的數(shù)量和功能2。但是，由于通過(guò)基因工程制備并經(jīng)聚乙二醇化的重組人MGDF在臨床試用過(guò)程中有中和性TPO抗體現(xiàn)象發(fā)生，美國(guó)FDA至今未批準(zhǔn)重組人TPO基因工程產(chǎn)品進(jìn)入臨床。TPO模擬肽(thrombopoietinmimeticpeptide,TMP)是一種與天然TPO生物學(xué)活性相似但又與其完全不同源的短肽，體外實(shí)驗(yàn)顯示TMP與巨核細(xì)胞表面的TPO受體c-Mp1

3、具有很高的親和力，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和性TPO抗體3。但是，由于TMP分子量非常小，不易通過(guò)基因工程方法進(jìn)行制備，同時(shí)在血液中也容易被降解，因此使得它在臨床上的推廣應(yīng)用受到很大限制。 近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人生長(zhǎng)激素(humangrowthhormone，hGH)具有顯著刺激巨核/巨核祖細(xì)胞增殖分化和促進(jìn)血小板生成的作用4。然而，由于hGH的生物學(xué)功能比較廣泛，其在促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成作用時(shí)的生物利用度相對(duì)較

4、低。為此，我們通過(guò)基因重組技術(shù)將TMP與hGH進(jìn)行融合，目的是使hGH在TMP引導(dǎo)下靶向聚集于巨核/巨核祖細(xì)胞的周圍，從而提高h(yuǎn)GH在促進(jìn)血小板生成時(shí)的生物利用度，另一方面，也使TMP得以通過(guò)基因工程方法進(jìn)行制備。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先將編碼rTMP-GH的基因序列克隆至原核表達(dá)載體pMAL-p2x中，通過(guò)與麥芽糖結(jié)合蛋白MBP進(jìn)行融合而實(shí)現(xiàn)rTMP-GH在大腸桿菌中的高效、可溶性表達(dá)，經(jīng)過(guò)柱層析純化、Xa因子酶切和再次純化，

5、最終獲得重組融合蛋白rTMP-GH，經(jīng)多方面的體外生物學(xué)活性驗(yàn)證后，進(jìn)一步觀察了該融合蛋白對(duì)急性重度骨髓型放射病小鼠血小板減少的促恢復(fù)作用。所取得的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下： 1.通過(guò)PCR擴(kuò)增、酶切、連接與轉(zhuǎn)化將編碼rTMP-GH的基因序列克隆至pMAL-p2x質(zhì)粒載體中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-rTMP-GH。陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21，經(jīng)0.1mol/L的IPTG于25℃誘導(dǎo)過(guò)夜，獲得高效、可溶性表達(dá)的MB

6、P-rTMP-GH融合蛋白(MBP-rTMP-GH占菌體總蛋白的55％以上)，采用疏水和陰離子柱層析獲得純化的融合蛋白MBP-rTMP-GH，經(jīng)Xa因子酶切去除MBP，再通過(guò)分子篩層析獲得純化的rTMP-GH(蛋白純度達(dá)95％以上)。 2.SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示純化所得的目的蛋白大小為24KD，與rTMP-GH的理論值一致；Westernblot結(jié)果表明該目的蛋白可以與人GH抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)純化所得蛋白為r

7、TMP-GH。 3.體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rTMP-GH融合蛋白與巨核細(xì)胞有很強(qiáng)的結(jié)合能力，提示融合蛋白中的TMP可以發(fā)揮特異性結(jié)合巨核細(xì)胞的作用；巨核細(xì)胞集落分析和MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，rTMP-GH融合蛋白能顯著促進(jìn)巨核細(xì)胞的增殖，其效果明顯優(yōu)于單純hGH和TMP處理組。 4.Westernblot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rTMP-GH能夠顯著上調(diào)體外培養(yǎng)巨核細(xì)胞中血小板生成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA-1的表達(dá)，進(jìn)一

8、步提示rTMP-GH具有促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖與分化和生成血小板的作用。 5.體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5Gyγ射線全身一次性照射可引起B(yǎng)alb/c小鼠外周血血小板顯著減少，并于第16天左右時(shí)達(dá)最低值(＜50,000/μl)。皮下注射400μg/kg的rTMP-GH融合蛋白，隔日一次，可顯著提高受照小鼠外周血血小板數(shù)目，其效果明顯優(yōu)于rhGH治療組和rhIL-11治療組。骨髓切片結(jié)果顯示，在照后第16天時(shí)空白對(duì)照組小鼠骨髓組織出血明顯，

9、有核細(xì)胞數(shù)顯著減少，巨核細(xì)胞尤為少見，骨髓出現(xiàn)空虛現(xiàn)象；而rTMP-GH處理組骨髓造血組織豐富，造血重建明顯，骨髓組織中有核細(xì)胞數(shù)量減少不明顯，僅有少部分空虛現(xiàn)象，并可見到不同時(shí)期的巨核細(xì)胞。提示體內(nèi)應(yīng)用。rTMP-GH融合蛋白具有顯著促進(jìn)血小板生成的作用。 總之，本研究通過(guò)基因工程方法成功實(shí)現(xiàn)了rTMP-GH重組融合蛋白在大腸桿菌中的高效、可溶性表達(dá)與純化制備，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明該融合蛋白具有顯著促巨核細(xì)胞增殖和血小板生