染色質三維結構調控干擾素誘導基因的表達.pdf

1、隨著染色體構象捕獲（Chromosome Conformation Capture，3C）及其衍生技術的發(fā)明以及在染色質高級結構研究領域的廣泛應用，人們逐漸對染色質的三維結構有了更深入的了解，進而認識到染色質的三維結構并不是隨機和雜亂的，而是逐步折疊形成染色質領域、開放/沉默染色質聚集區(qū)、拓撲相關結構域和染色質loop結構等具有一定規(guī)律和層次的高級結構。進一步人們還發(fā)現(xiàn)，染色質的三維結構與基因的表達調控是密切相關的。基因的啟動子和終止子

2、間的基因loop結構保證轉錄方向的唯一性和RNA聚合酶的循環(huán)利用，遠距離的增強子和沉默子分別通過與啟動子間的相互作用激活和抑制基因的轉錄，絕緣子間的相互作用和拓撲相關結構域隔離內部的調控元件，使之不干擾外部的基因的表達。功能相關的基因借助轉錄工廠協(xié)同表達協(xié)同調控。
　　干擾素（Interferon，IFN）是一種廣譜的抗病毒蛋白，但是其本身并沒有直接的抗病毒作用，而是通過JAK-STAT信號通路激活眾多干擾素誘導基因的表達，進而利

3、用干擾素誘導基因表達的蛋白在病毒的進入、復制、轉錄、翻譯和釋放等各個過程對病毒產生抑制作用。盡管已經(jīng)有較多的文獻表明干擾素基因的表達調控需要染色質三維結構的參與，但是，對于染色質三維結構對干擾素誘導基因的表達調控還沒有文獻報道。因而，我們的科學問題就是：染色質三維結構在干擾素誘導基因的表達調控中發(fā)揮著什么樣的作用？為回答這一科學問題，我們主要以干擾素誘導基因IFITM（Interferon-Induced Transmembrane p

4、rotein）和MX1（Myxovirus resistance protein1）為研究對象，在解析局部染色質構象或掃描全基因組范圍相互作用的基礎上，對其表達調控機制進行了一系列的研究。
　　第一部分：干擾素誘導的增強子通過遠距離相互作用協(xié)同調控IFITM1，2和3基因的表達
　　人類IFITM1，2和3基因位于11號染色體上，成簇存在。它們在多種組織和細胞中都有本底表達，并且能夠被干擾素大量誘導表達。IFITM蛋白能夠通

5、過抑制內吞體膜與病毒包膜的融合等機制抑制病毒進入細胞，對流感病毒、埃博拉病毒、登革病毒、馬爾堡病毒、西尼羅河病毒、非典型肺炎冠狀病毒等都有抑制作用，是廣譜的抗病毒蛋白。IFITM基因編碼區(qū)和調控區(qū)的核苷酸多態(tài)性可能會導致不同人群對疾病的感染的易感性不同或影響病情的嚴重程度。因此，研究IFITM基因的表達調控具有重要的意義，而增強子作為一類重要的基因表達調控元件，其對IFITM基因的表達調控目前還沒有文獻報道。
　　我們整合ENCO

6、DE以及其它公開資源中RNA聚合酶II的ChIA-PET相互作用、組蛋白修飾H3K4me1和K3K27ac、DNase I超敏感位點、轉錄因子P300、STAT1和STAT2結合位點等多種組學數(shù)據(jù)以及熒光素酶報告基因實驗，首次在IFITM3啟動子的上游35kb左右鑒定到一個干擾素誘導的增強子E2-3。并且，利用CRISPR在HEK293細胞中將該增強子截短、破壞了其增強子活性后，相比于野生型細胞，干擾素誘導的IFITM1，2和3基因的表

7、達在mRNA和蛋白質水平均出現(xiàn)了明顯下調，說明IFITM1，2和3基因是增強子E2-3的靶基因。
　　干擾素通過JAK-STAT信號通路誘導基因的表達。利用染色質免疫沉淀技術，我們發(fā)現(xiàn)，干擾素處理后，干擾素信號通路相關的轉錄因子STAT1結合于E2-3，并且將STAT1結合motif突變后，熒光素酶報告實驗表明E2-3的增強子活性下調。說明增強子E2-3的功能依賴于STAT1的結合。
　　鑒于增強子E2-3與IFITM基因座

8、位的距離有35kb之遠，我們猜測E2-3通過與IFITM啟動子的遠距離的相互作用來發(fā)揮作用。HEK293和A549細胞中的3C實驗驗證了E2-3與IFITM1，2和3基因啟動子的組成性相互作用，并且發(fā)現(xiàn)IFITM1，2和3基因的啟動子本身之間也存在著相互作用，提示IFITM1，2和3基因可能聚集在一起，被增強子E2-3通過遠距離相互作用協(xié)同調控。另外，我們還發(fā)現(xiàn)在增強子E2-3被截短的HEK293細胞中這些相互作用也依然存在，提示介導這

9、些組成性的相互作用的因子可能結合于E2-3區(qū)域之外。
　　流感感染會刺激干擾素的表達，進而誘導IFITM基因的表達，抵抗病毒的感染，因此我們在流感感染細胞的模型中，評估增強子E2-3介導的功能。用流感病毒分別感染野生型和截短增強子的HEK293細胞，我們發(fā)現(xiàn)雖然野生型和截短組細胞IFITM1，2和3基因的表達均出現(xiàn)了上調，但是截短組IFITM1，2和3基因的表達明顯低于野生型組，這再次驗證了增強子E2-3對IFITM基因表達的調控

10、作用。而且，當流感病毒感染經(jīng)干擾素預先處理的細胞時，截短組細胞中病毒復制得更多，說明截短增強子E2-3降低了干擾素誘導的對流感病毒的抵抗力。
　　綜上，我們第一次報道了一個調控IFITM基因表達的增強子，并且發(fā)現(xiàn)，該增強子通過組成性的遠距離相互作用和干擾素誘導的STAT1的結合協(xié)同調控干擾素誘導的IFITM1，2和3基因的表達，進而促進干擾素誘導的對流感病毒的抵抗。這些發(fā)現(xiàn)顯示出染色質三維結構在干擾素誘導基因表達調控中發(fā)揮著重要的

11、功能，同時也極大地拓展了我們對于增強子在IFITM基因轉錄調控和干擾素抵抗病毒感染中的作用與機制的認識，進而會促進我們對于天然免疫背后復雜的機制的理解，并且為發(fā)現(xiàn)新的疾病易感位點以及藥物作用靶點等提供了線索。
　　第二部分：染色質三維結構參與MX1基因的表達調控
　　人類MX1基因位于21號染色體上，可被干擾素誘導表達。MX1基因編碼的MX1蛋白是一種GTPase，具有廣譜的抗病毒作用，能夠抑制流感病毒、Thogoto病毒、

12、La Crosse病毒、水皰性口炎病毒、漢坦病毒和乙肝病毒等多種病毒的感染。盡管 MX1在抗病毒免疫中發(fā)揮著如此重要的作用，但是目前對于 MX1基因的表達調控機制的研究還比較少，特別是染色質三維結構在MX1表達調控中的作用還沒有文獻報道。
　　我們利用環(huán)形染色體構象捕獲結合高通量測序技術（Circular Chromosome Conformation Capture combined high-throughput sequen

13、cing，4C-seq）技術，首次獲得了干擾素處理前后MX1基因啟動子的相互作用譜。結果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)相互作用是順式相互作用，這與染色質領域的概念相一致。并且，我們還發(fā)現(xiàn)，一半以上相互作用是組成性相互作用，即無論干擾素處理與否，均與MX1基因啟動子相互作用。
　　為研究MX1基因相互作用片段的表觀遺傳學特征，我們從GEO數(shù)據(jù)庫中獲取了A549細胞的組蛋白修飾、組蛋白變體和轉錄因子的ChIP-seq數(shù)據(jù)，進而分析了這些組蛋白修飾、組蛋

14、白變體和轉錄因子在MX1基因相互作用區(qū)域的富集情況，結果發(fā)現(xiàn)，干擾素處理前后的相互作用區(qū)域均富集活躍的組蛋白修飾、組蛋白變體和起激活作用的轉錄因子，而沉默的組蛋白修飾和起抑制作用的轉錄因子則沒有富集。說明在干擾素處理前后，MX1基因的啟動子均傾向于與開放的染色質區(qū)域共定位。
　　進一步分析干擾素處理后的相互作用片段，我們發(fā)現(xiàn)MX1基因上游約3.3Mb和210kb處的兩個相互作用片段具有增強子樣的表觀遺傳學修飾。利用熒光素酶報告實驗

15、，我們驗證了這兩個片段確實是增強子，提示這兩個增強子可能在干擾素處理后通過遠距離相互作用促進MX1基因的表達。并且我們還發(fā)現(xiàn)，將這兩個增強子人為串聯(lián)在一起時，其增強子作用進一步提高，說明這兩個增強子在調控MX1基因表達時可能存在協(xié)同作用。
　　許多研究表明功能相關的基因會共定位于轉錄工廠中協(xié)同表達。利用我們的4C數(shù)據(jù)分析MX1相互作用的基因發(fā)現(xiàn)，干擾素誘導基因MX2和ITSN1以及干擾素受體基因IFNAR1、IFNAR2 IFNG

16、R2和IL10RB等均與MX1存在著廣泛的相互作用，提示MX1基因與干擾素功能相關的基因很可能共定位于轉錄工廠協(xié)同表達。
　　綜上，我們第一次獲得了干擾素處理前后MX1基因的相互作用譜，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)相互作用是染色體內相互作用，并且相互作用片段主要是活躍的開放染色質區(qū)域，驗證了染色質領域和開放/閉合染色質聚集區(qū)的存在。我們還從MX1相互作用片段中鑒定到增強子以及干擾素誘導基因和干擾素受體基因，提示啟動子-增強子相互作用和轉錄工廠等染