ERK5信號通路在成骨細胞凋亡以及小鼠骨質疏松癥發(fā)生中的作用.pdf

1、目的：流體剪切應力（FSS）可以抑制成骨細胞的凋亡。但是，ERK5在流體剪切應力介導的抗成骨細胞凋亡效應中的作用還不清楚，ERK5在體內對骨代謝平衡的影響也未見報道。因此，對 ERK5信號通路在成骨細胞凋亡和骨質疏松中的作用進行研究，能夠為臨床治療骨質疏松提供新的治療靶標。
　　方法：將FSS作為激活ERK5的機械刺激，XMD8-92（ERK5特異性抑制劑）或ERK5-siRNA為抑制ERK5活性的干預措施，分別通過FSS、TNF

2、-α、XMD8-92、ERK5-siRNA單獨或多種干預后的MC3T3-E1細胞進行Hoechest33258染色、TUNEL特異性凋亡染色、流式細胞技術來檢測凋亡比率、使用PCR array檢測ERK5下游凋亡相關的因子變化、使用酶標儀檢測 caspase-3的活性，以及使用Western blotting來檢測各種蛋白的表達變化；對小鼠腹腔注射XMD8-92和/或地塞米松（DEX），觀察小鼠股骨骨組織的微觀結構、力學性質、增殖或凋亡

3、相關蛋白、以及脂肪細胞數(shù)量的變化。
　　結果：低濃度（1 ng/ml）的TNF-α對成骨細胞沒有凋亡誘導作用，但是高濃度的TNF-α（10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）可以誘導成骨細胞凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性。加載生理條件下的FSS（12dyn/cm2）1小時，可以明顯促進成骨細胞內的ERK5的磷酸化，磷酸化后的ERK5會從胞漿轉移至細胞核內。5μM的XMD8-92和ERK5-siRNA可以阻斷或者減少成骨細胞內FSS

4、介導的ERK5激活。FSS可以抑制TNF-α誘導的成骨細胞凋亡，細胞凋亡率從34.2％減少到13.8%。XMD8-92或者ERK5-siRNA能夠加劇成骨細胞的凋亡，并且能夠逆轉FSS的抗成骨細胞凋亡的效應。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，XMD8-92能夠抑制成骨細胞內Bad的磷酸化，且FSS介導的Bad的磷酸化也能夠被XMD8-92所阻斷。與TNF-α處理組相比，在ERK5-siRNA+TNF-α成骨細胞內akt基因表達被抑制，而fasl、bim

5、、caspase-3的基因表達卻被激活。進一步的實驗結果表明ERK5-siRNA的轉染能夠阻斷 FSS誘導的成骨細胞內 ERK5，AKT，F(xiàn)oxO3a的激活。AKT抑制劑LY294002能夠抑制AKT-FoxO3a信號通路的激活，但不能抑制ERK5的激活。ERK5基因沉默增加了 TNF-α誘導的成骨細胞內 FasL和 Bim的表達，以及caspase-3的活性；但是，F(xiàn)SS介導的ERK5激活卻能夠下調TNF-α誘導的成骨細胞內FasL和

6、Bim的表達，以及降低caspase-3的活性。體內實驗表明，腹腔注射XMD8-92可以抑制小鼠骨組織內ERK5的磷酸化；形態(tài)學和生物力學檢測研究表明XMD8-92可以使小鼠骨量減少，并加劇地塞米松誘導的骨質疏松；我們還發(fā)現(xiàn) XMD8-92上調了小鼠骨組織內和成骨細胞內的RANKL/OPG的比率和FasL的表達，但是抑制了Cyclin B1和CDK1的表達，從而導致成骨細胞的凋亡增多而增殖減少，引起了骨質疏松的發(fā)生；另外。XMD8-92

7、也可以增加小鼠骨組織內脂肪細胞的數(shù)量。有趣的是，XMD8-92也同樣加劇了DEX誘導的上述指標的變化。
　　結論：⑴FSS通過ERK5信號通路抑制成骨細胞凋亡的機制：FSS產(chǎn)生生物學信號并傳遞至成骨細胞內而激活ERK5，磷酸化的ERK5發(fā)生構象改變，并轉位至細胞核內；a，磷酸化的ERK5能夠促使Bad發(fā)生磷酸化，激活后的Bad與14-3-3蛋白結合而被隔離在細胞漿中，并不能被轉移至線粒體內，從而抑制了Caspas-3的活性。b，活

8、化后的ERK5激活 AKT，磷酸化的AKT進一步促進FoxO3a的磷酸化，磷酸化后的FoxO3a與14-3-3蛋白結合而被隔離在細胞漿中，從而導致其下游的前凋亡相關蛋白FasL和Bim的表達減少，最終導致Caspase-3的活性的降低，最終抑制了成骨細胞的凋亡。⑵ERK5參與骨質疏松的具體機制有4條：ERK5的失活會導致a，小鼠骨組織內RANKL/OPG蛋白表達的比例上調；b，抑制Cyclin B1/CDK1蛋白的表達，從而使得成骨細胞