通過全外顯子測序在神經退行性病變家系中鑒定出PLA2G6基因的復合突變.pdf

1、醫(yī)學遺傳學研究的一個重要領域是探索人類疾病的遺傳變異，從而為疾病的診斷、預防及其治療提供理論基礎[1]。多種方法已經被用于疾病遺傳變異的分析，隨著新一代測序技術的進步，特別是2009年，科學家第一次應用全外顯子組測序技術(Whole exome sequencing，WES)在4名弗里曼謝爾登綜合征（常染色體顯性遺傳?。┲邪l(fā)現了位于MYH3基因中的點突變，顯示出WES在遺傳病致病基因鑒定中的強大功效。
　　傳統(tǒng)的連鎖分析(Link

2、age analysis)和關聯研究(Association study)，已成功鑒定約1/3的遺傳病的致病基因[2]和一些精神分裂癥[3，4]、腫瘤等疾病的易感基因位點。然而對于家系成員過少（或不齊全）、致病基因外顯率過低或位點異質性高的孟德爾遺傳病，連鎖分析的效能則會明顯減弱[5]。而關聯研究揭示的易感位點只能解釋疾病的一小部分遺傳度[6]。此外，隨著易感位點的最小等位基因頻率(Minorallele frequency,MAF)逐

3、漸下降，關聯研究達到足夠檢驗效能所需的樣本含量往往呈指數級增長[7]，因此通過關聯研究鑒定得到的位點多為致病效力微弱的常見變異(MAF＞0.05)，而對低頻變異(MAF＜0.05)和罕見變異(MAF＜0.01)的檢測能力十分有限[8]。
　　高通量測序技術的出現特別是性價比比較高的全外顯子組測序(wholeexome sequencing，WES)極大的改善和加速了遺傳病致病基因的挖掘。人類基因組由約3×109個堿基組成，這包含了

4、編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中約3×108(1％)個是編碼區(qū)，據估計85％的引起疾病的突變都位于基因組的編碼區(qū)及功能區(qū)[9，10]，因此對基因組的編碼區(qū)（全外顯子組）進行測序可以很好的揭示大量的單基因的稀有的遺傳病及常規(guī)疾病和癌癥中的誘發(fā)性突變。
　　外顯子組測序基本流程包括外顯子區(qū)域序列的富集、高通量測序及測序數據的生物信息學分析。對外顯子區(qū)域進行富集首先需要將足量復合質量標準的基因組DNA使用超聲破碎儀打斷成小片段，并與能夠覆蓋外顯子

5、組的探針進行雜交，然后洗去未雜交的DNA片段，最后將雜交的DNA片段洗脫下來，連接接頭(或index)等進行PCR擴增。高通量測序是以Illumina公司的Solexa和Hiseq二代測序技術為主[11,12]，近兩年來，LifeTechnologies推出了基于多重PCR的AmpliSeq外顯子捕獲方法，結合Ion torrent測序平臺能顯著縮短實驗周期而逐漸受到研究人員的青睞[13,14]，隨著技術的快速發(fā)展，市場上還出現了以Pa

6、cBio的SMRT技術和Oxford的Nanopore技術為代表的三代測序技術[15,16]，極大的改善了測序的準確度。生物信息學分析主要是挖掘變異位點，包括SNP和Indels。首先是通過質控排除測序中提質量的Reads，然后將高質量的reads與參考基因組進行比對，統(tǒng)計SNP和Indels，然后經過一系列公共的突變數據庫如ESP6500，1000Genome等或inhouse數據庫進行已知突變的過濾，最后對過濾后的突變進行注釋，然后

7、根據基因的功能結合疾病的類型等深入分析，最終確定候選的變異位點。
　　鑒于外顯子測序技術已經成為鑒定遺傳突變的強有力工具，我們課題組致力于采用這一強有力技術篩選候選致病位點，并且已經在常染色體顯性遺傳的眼球震顫及腰椎滑脫等家系中成功發(fā)現了相關致病基因[17，18]。在本論文中，我們應用WES測序技術結合課題組自己研發(fā)的可以整合分析WES測序數據的MirTrios[19]對一個家系進行了分析，在患者中發(fā)現了PLA2G6基因的復合突變

8、，從而正式確診了該病屬于伴隨腦部鐵離子沉積的神經退行性病變的一個亞型:PLA2G6相關的神經退行性病變(PLAN)，而非最初臨床初步診斷的小腦共濟失調。
　　目的：
　　通過對一個散發(fā)的伴有運動功能障礙的患兒及其父母在內的的5個家庭成員進行全外顯子組測序(WES)，經過生物信息學分析來挖掘與疾病相關的新生突變及稀有突變。
　　方法：
　　1.散發(fā)家系成員的募集及外周血的采集
　　2.DNA的提取及全外顯子捕

9、獲測序
　　3.測序數據的生物信息學分析及驗證
　　4.候選致病基因的表達譜分析
　　結果：
　　1.家系中只有患兒檢查出明顯的臨床表型，主要表現為小腦共濟失調、社交言語困難及智力處于中下水平等。
　　2.在所研究的家系中發(fā)現了PLA2G6基因的一個新生突變c.1634A＞G和一個稀有突變c.1077G＞A。新生突變c.1634A＞G位于磷脂酶催化域的保守區(qū)，稀有突變c.1077G＞A位于錨蛋白重復序列上，

10、突變后導致可變剪切的錯誤，二個突變的發(fā)生都可能會導致蛋白功能的嚴重受損。
　　3.候選致病基因PLA2G6廣泛表達于各個腦區(qū)，隨年齡的變化表達量比較穩(wěn)定，沒有大的波動。
　　結論：
　　1.WES和新的生物信息學技術對異質性強的遺傳病的致病突變的尋找是十分有效的。
　　2.本研究鑒定出的PLA2G6的復合突變很可能導致了該家系中患者的表型。
　　3.本研究鑒定的新的PLA2G6基因相關致病基因突變擴充了PL