海洋嗜熱菌的篩選、熱穩(wěn)定脂肪酶性質及其熱適應機理研究.pdf

1、史前地球表面的一個特點是高溫炎熱，因此嗜熱性是一種原始生命的特性。生物的一個基本特征是對環(huán)境的適應性，微生物作為地球上最早形成的第一類生命體征，對高溫的適應能力尤為驚人?？梢韵胂笤诘厍虮砻鏈囟戎饾u降低的過程中會出現(xiàn)各種各樣的嗜溫細菌，嗜熱細菌則可能是嗜溫細菌適應高溫環(huán)境的產物。 鑒于嗜熱菌在基因工程、蛋白質工程、發(fā)酵工程及礦產資源的開發(fā)利用上均有很大的應用價值和開發(fā)前景，近些年來國內外科研人員都對嗜熱菌的研究展示了極大興趣。

2、 本論文從太平洋深海熱液區(qū)和廈門近海溫泉分離到50株嗜熱菌，進一步對它們的產脂肪酶能力進行了篩選，其中TW-1產脂肪酶能力最強。在16S rDNA鑒定的基礎上，TW-1歸屬為Gebacillus sp.。隨后，對TW-1菌的脂肪酶基因進行了克隆及在Escherichia coli中的表達。結果表明，該酶基因長1254bp，編碼417個氨基酸。重組脂肪酶的最適反應溫度在40℃左右，在90℃時約有10％酶活。重組脂肪酶的最適pH值在

3、7-8，在pH6.0-9.0范圍內保留80-100％的活性。該酶在1mM的變性劑(EDTA，2-ME，SDS，PMSF或DTT)和0.1％的去污劑(Tween 20，Chaps或Triton X-100.)作用下，EDTA、2-ME、SDS可以抑制大約18-30％的重組脂肪酶及粗酶活性，DTT和PMSF對酶活基本無影響。0.1％Tween 20、Chaps和的TritonX-100對粗酶酶活幾乎無什么影響，而對重組脂肪酶的酶活有5-10

4、％的抑制。在ImM或5mM的Ca2+，Mg2+，Zn2+，I mM的Fe2+and Fe3+作用下，酶活均增強到了103-283％，1 mM的LiCI，CuCl2或MnCl+對酶活有輕微的抑制，5 mM的CuCl2或MnCl2作用下完全測不到酶活。Fe2+，F(xiàn)e3+形成沉淀，無法測定脂肪酶活性。本研究提供了一種快速、有效、大量獲取高溫脂肪酶的方法，在工業(yè)上具有廣泛應用前景。 為了探索嗜熱菌的熱適應性機理，本文以近海溫泉分離獲得

5、的Thermusthermophilus WL為材料，采用蛋白質組學進行研究。根據(jù)已測序T.thermophilus的基因組序列，建立其開放閱讀框(ORF)數(shù)據(jù)庫。通過不同溫度下全菌蛋白的SDS-PAGE及Trieine-SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，圖譜以最適生長溫度(70℃左右)為分界線呈兩種帶型，低于最適生長溫度為一種帶型，等于或高于生長溫度為另一種帶型。將其中l(wèi)l條差異明顯的條帶進行質譜鑒定，在ORF數(shù)據(jù)庫比對后獲得相應的基因。為了

6、尋找更多與熱適應性相關的蛋白，進一步采用雙向電泳對55℃75℃兩個溫度下的全菌蛋白樣品進行分析，將75℃條件下蛋白表達量明顯上調的10個點進行質譜鑒定。通過蛋白質組學分析，共有17種蛋白在高溫下上調表達。對差異表達蛋白相應的基因進行標記，采用Northem blot檢測基因轉錄量，結果17種基因均明顯上調表達，與蛋白電泳圖譜結果一致。對高溫差異表達的超氧化物岐化酶、延胡索酸水化酶、轉錄與釋放因子基因進行重組表達及抗體制備后，利用West

7、ern blot進行驗證，結果可檢測到3種基因的表達產物。Northem blot和Western blot分析證實了蛋白質組學的分析結果。 從17個基因中選擇SOD進行基因功能研究，利用基因插入失活手段將耐高溫的卡那霉素編碼基因插入SOD基因中間，構建SOD突變株。通過含卡那霉素平板在65℃下篩選突變株，獲得SOD基因失活的突變株。提取突變株基因組DNA，經PCR檢測正確后，PCR產物進行測序分析，結果表明構建的突變株正確。

8、標記卡那霉素編碼基因，對突變株進行Northern blot，結果發(fā)現(xiàn)卡那霉素基因有轉錄產物；以SOD特異的抗體進行Western blot分析，結果SOD突變株中檢測不SOD。在上述試驗證實SOD突變株正確的前提下，測定突變株的生長曲線。結果顯示，突變株與野生型菌株相比，最適生長溫度下降，最高生長溫度也下降Ts"c，從80℃下降到75℃為了證明溫度下降與SOD缺失有關，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的重組SOD，發(fā)現(xiàn)在接種12d,時左右后，突

9、變菌株在80℃下恢復生長。這些結果說明，SOD與嗜熱菌的熱適應性有關。 蛋白質組學研究表明17種蛋白與嗜熱菌的熱適應性有關，為了了解這些蛋白通過何種途徑參與熱適應性，本文選用SOD進一步進行蛋白質互作研究。采用免疫共沉淀技術，從T.thermophilus WL中獲得與其結合的蛋白，經質譜鑒定為2-酮異戊酸脫氫酶亞基。2-酮異戊酸脫氫酶基因重組表達，純化重組蛋白制備抗體，Western blot結果表明，與SOD結合的蛋白是2

10、-酮異戊酸脫氫酶。利用細菌雙雜交系統(tǒng)，將SOD和2-酮異戊酸脫氫酶相應的基因克隆在質粒中，隨后共轉化，通過選擇性培養(yǎng)基進行篩選。結果顯示，SOD和2-酮異戊酸脫氫酶存在相互作用。將2-酮異戊酸脫氫酶亞基進行分段克隆，以尋找特異的作用區(qū)域，結果表明，它只在整個分子水平發(fā)生相互作用。上述結果表明，SOD通過能量代謝途徑采用嗜熱菌的熱適應反應。 通過以上的研究發(fā)現(xiàn)，參與嗜熱菌熱適應的蛋白主要是能量代謝相關蛋白、染色體穩(wěn)定性相關蛋白、