吡唑環(huán)氧烷衍生物3g對結腸癌細胞自噬和細胞周期的調節(jié)及分子機制研究.pdf

1、研究背景和研究目的
　　結腸癌在在人類常見的癌癥中的被診斷率已經躍居第三位。在癌癥的治療中，除了局部切除治療外，化療仍然是一個普遍并有效的方式。許多聯合給藥的治療方案中，化療藥物都具有一定的毒副作用。篩選新型小分子化合物抑制腫瘤細胞生長并且研究其具體機制仍然是研究中的熱點。并且通過化學遺傳學的方法研究細胞程序性死亡和細胞周期的具體機制能夠為促進藥物開發(fā)，為腫瘤治療打下理論基礎。
　　細胞程序性死亡可以被分為三大類，凋亡是其中

2、的一個重要類型，在多細胞生物的正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)保持中有著關鍵的調控作用。凋亡是去除不需要的、衰老的和受損的細胞的重要機制，凋亡的失調會導致多種疾病，其中包括癌癥的發(fā)展。自噬是另一類重要的細胞程序性死亡，在正常條件下可以通過降解多余的細胞器和細胞內錯誤折疊的蛋白等，來提供營養(yǎng)用以維持細胞正常的生命活動。但是在凋亡缺陷性細胞的死亡中，自噬又是細胞死亡必需的，這表明了自噬的雙重性。自噬的調節(jié)是一個精密而復雜的基因調控過程，在各階段都受到多種調節(jié)

3、因子的作用。自噬可以分為mTOR依賴途徑和mTOR非依賴途徑，在前者中主要的分子機制是通過Akt/mTOR信號通路和其下游底物發(fā)揮作用，并參與調節(jié)翻譯和細胞生長。而細胞自噬和周期也相互聯系，并且mTOR在其中發(fā)揮重要作用。
　　在我們實驗室的前期工作中，發(fā)現在除血清和生長因子條件誘導的血管內皮細胞的凋亡過程中，小分子化合物3g通過誘導Ingerinβ4蛋白磷酸化并誘導入核，從而有效地誘導血管內皮細胞凋亡。但是其是否能夠在腫瘤細胞中

4、發(fā)揮抑制生長的作用從而成為一個有效的腫瘤治療藥物則還不清楚。而且其是否會對正常細胞的生長產生影響是尋找新型藥物的重點之一，尋找到能夠特異性抑制腫瘤細胞的化合物能夠為藥物開發(fā)提供新的前景。
　　磷脂酰乙醇胺結合蛋白1(PEBP1)，也被稱為Raf激酶抑制蛋白，參與了MAPK，GPCR，NF-κB，GSK3β等多種細胞生長相關的信號通路的調控。PEBP1可以通過參與多種將細胞外刺激轉化成不同信號以維持細胞完整性和體內平衡的通路。結腸癌

5、患者的PEBP1啟動子甲基化程度遠遠高于正常樣本，這表明了其異常在結腸癌起始中潛在的重要性。而且最新的研究中PEBP1和LC3的直接相互作用得到了驗證，PEBP1通過保守的LIR基序和LC3結合并且抑制營養(yǎng)剝奪的自噬，而且是通過PEBP1 S153的磷酸化發(fā)揮作用的。
　　本研究利用化學遺傳學的原理與技術，以化合物小分子3g為研究工具，研究了其特異性抑制結腸癌細胞生長中的具體分子機制，確定了其在調控細胞自噬和細胞周期中發(fā)揮的作用，

6、為結腸癌的治療提供新的靶點和有效工具。
　　研究方法：
　　1.人結腸癌Hct116細胞、人臍靜脈血管內皮細胞、人肺腺癌A549細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人前列腺癌PC3細胞的培養(yǎng)
　　2.倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化
　　3.SRB法檢測細胞存活率
　　4.Heochest染色后，通過熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)的變化，從而判斷細胞是否凋亡
　　5.LDH（乳酸脫氫酶）檢測細胞是否發(fā)生壞死

7、　　6.流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期
　　7.激光共聚焦顯微鏡檢測LC3-Ⅱ的分布
　　8.western blot檢測PARP和caspase-3蛋白切割水平，LC3-Ⅱ和p62蛋白表達水平，以及Akt，mTOR，P70S6K，4EBP1，PEBP1的磷酸化水平
　　9.雞胚尿囊膜人移植瘤模型研究小分子化合物對實體瘤進展和正常血管生成的影響
　　研究結果：
　　1.吡唑環(huán)氧烷衍生物具有對多種腫瘤細胞的

8、生長抑制作用
　　1.1.SRB檢測結果表明，小分子化合物3g（1-10μM）作用于多種腫瘤細胞后，均能顯著抑制細胞的存活。其中，化合物對結腸癌細胞Hct116細胞的抑制作用最強。并且在同樣濃度下不影響正常培養(yǎng)條件的血管內皮細胞生長。
　　1.2.倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現，化合物3g（2.5-10μM）處理Hct116細胞24h后，細胞逐漸變圓。而3g處理A549細胞24h后，細胞發(fā)生了明顯的拉長。
　　1.3.

9、Heochest染色結合熒光顯微鏡觀察化合物3g(2.5-10μM)處理腫瘤細胞24h后，核凝集現象與對照組相比變化不明顯。
　　1.4流式細胞術結果表明，化合物3g(5μM)處理Hct116細胞24 h后，處理組與對照組相比凋亡率沒有發(fā)現顯著升高
　　1.5.Western-blot檢測在12h、24h、48h時3g(5μM)可能不能誘導PARP和caspase-3切割上調。
　　1.6.LDH檢測發(fā)現，化合物3g(

10、10μM)處理多種腫瘤細胞48h后，培養(yǎng)液上清中LDH活性沒有顯著性差異，表明細胞沒有發(fā)生壞死。
　　2.小分子化合物3g通過調節(jié)細胞自噬和細胞周期發(fā)揮抑制作用
　　2.1.通過流式細胞術發(fā)現3g(5μM)處理Hct116細胞24h后會引起G1期細胞阻滯。
　　2.2.western blot結果表明，設計不同的時間點使用3g(5μM)處理Hct116細胞后，與對照組相比，3h、6h時Hct116細胞中LC3-Ⅱ表達顯

11、著增強，而在48h時自噬流被明顯阻斷。
　　2.3.免疫細胞化學檢測發(fā)現，3g(5μM)處理Hct116細胞3h后，與對照組相比，Hct116細胞中LC3出現了點狀聚集。
　　2.4.western blot結果表明，使用3g(5μM)處理Hct116細胞后，與對照組相比，短時間內Hct116細胞中Akt和mTOR的磷酸化被抑制。
　　2.5.western blot結果表明，使用3g(5μM)處理Hct116細胞后，

12、與對照組相比，短時間內Hct116細胞中mTOR的底物P70S6K和4EBP1的磷酸化被抑制。
　　2.6.Western blot結果表明，使用3g(5μM)處理Hct116細胞后，與對照組相比，短時間內Hct116細胞中PEBP1的磷酸化被抑制。
　　2.7.雞胚尿囊膜人移植瘤模型在3g處理后，對比對照組，處理組的實體瘤發(fā)展被明顯抑制，并且不影響其正常血管的發(fā)生。
　　結論：
　　1.小分子化合物3g能夠顯著

13、抑制多種人腫瘤細胞存活，且抑制作用呈現濃度的依賴性，其中對Hct116細胞的抑制作用最強，并且在同樣濃度下不影響正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍靜脈血管內皮細胞。
　　2.小分子化合物3g不是通過誘導凋亡來抑制Hct116細胞的生長。小分子化合物3g能夠在短時期內誘導自噬，而在長時間時阻斷自噬流，并且發(fā)揮誘導細胞周期阻滯的作用。其具體分子機制是通過在短期內誘導PEBP1 S153位點的磷酸化，并抑制Akt/mTOR信號通路實現的。PEBP1的