白花丹醌對血瘀型肝纖維化大鼠干預機制的實驗研究.pdf

1、目的：通過四氯化碳（CCL4）、小牛血清白蛋白（BSA）和去甲腎上腺素（NE）多因素致大鼠血瘀型肝纖維化建立血瘀型肝纖維化動物模型，選擇白花丹醌作為研究對象，觀察白花丹醌干預前后對大鼠肝功能相關(guān)指標（AST、ALT和SOD等）和肝纖維化相關(guān)因子（HA、LN和PC III等）的含量變化，利用HE染色和Masson染色，觀察白花丹醌干預前后肝組織肝纖維程度的變化， WB法檢測LSEC細胞中HSPG2蛋白的表達。探討白花丹醌對血瘀型肝纖維化的

2、干預機制，為血瘀型肝纖維化的防治奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.血瘀型肝纖維化大鼠模型的制備。
　　2.檢測血清中ALT、AST、TBil、ALP、SOD和MDA的含量變化。
　　3.化學發(fā)光法測定血清中LN、Col IV、PC III和HA的含量變化。
　　4.ELISA法測定血清中CTGF的含量變化。
　　5.HE染色和Masson膠原染色肝組織觀察肝纖維化程度及分期評分。
　　6.WB檢測

3、LSEC細胞中HSPG2蛋白的表達
　　結(jié)果：
　　第一部分、白花丹醌干預前后對血瘀型肝纖維化大鼠肝功能相關(guān)指標、肝纖維化相關(guān)因子和肝纖維化程度的影響
　　（1）血清中ALT、AST、TBil、ALP、SOD和MDA的含量變化:與空白對照組比較，模型對照組血清中ALT、AST、ALP、TBil和MDA含量均升高，SOD含量降低，比較結(jié)果具有極其顯著性差異（P﹤0.01），證實大鼠肝纖維化模型已經(jīng)成型；與模型對照組比較，

4、白花丹醌治療組、秋水仙堿組和丹參酚酸B組大鼠血清中ALT、AST、ALP、TBil和MDA含量均顯著下降（P﹤0.05），SOD含量升高，其中白花丹醌高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組；與秋水仙堿組比較，白花丹醌高劑量組TBil含量下降，比較結(jié)果具有顯著性差異（P﹤0.05）；與丹參酚酸B組比較，白花丹醌高劑量組和秋水仙堿組ALT、AST、ALP、TBil和MDA含量均下降，SOD含量升高，比較結(jié)果具有顯著性差異（P﹤0.05）。
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5、2）化學發(fā)光法測定血清中LN、Col IV、PC III和HA的含量變化：與空白對照組比較，模型對照組中LN、HA、PC III和HA含量均上升，比較結(jié)果具有極其顯著性差異（P﹤0.01）；與模型對照組比較，白花丹醌治療組中LN、HA、PC III和HA含量均下降，比較結(jié)果具有顯著性差異（P﹤0.05），其中白花丹醌高劑量組的效果優(yōu)于低劑量組；與秋水仙堿組比較，白花丹醌高劑量組中LN、HA、PC III和HA含量均下降，比較結(jié)果具有顯著

6、性差異（P﹤0.05）；與丹參酚酸B組比較，白花丹醌高劑量組和秋水仙堿組中LN、HA、PC III和HA含量均下降，比較結(jié)果具有顯著性差異（P﹤0.05）。
　?。?）ELISA法測定血清中CTGF含量變化結(jié)果：與空白對照組比較，模型組血清中CTGF含量明顯升高，比較結(jié)果具有極其顯著性差異（P﹤0.01）；與模型對照組比較，白花丹醌治療組血清中CTGF含量均下降，比較結(jié)果具有顯著性差異（P﹤0.05），其中白花丹醌高劑量組的降低效

7、果優(yōu)于低劑量組；與秋水仙堿組比較，白花丹醌高劑量組大鼠血清中CTGF含量下降，比較結(jié)果有顯著性差異（P﹤0.05）；與丹參酚酸B組比較，白花丹醌高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中含量均偏低，比較結(jié)果有顯著性差異（P﹤0.05）。
　?。?）HE染色和Masson膠原染色觀察肝纖維化程度及分期評分
　　A組正常組中肝組織中肝小葉細胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，肝細胞未見脂肪變性，纖維組織沒有出現(xiàn)增生，肝臟組織結(jié)構(gòu)完好。B組模型

8、組中肝組織中可見明顯的纖維組織增生，假小葉形成，肝脂肪細胞變性，肝細胞出現(xiàn)炎癥浸潤，證實大鼠肝纖維化模型已經(jīng)成型。C組白花丹醌高劑量組和D組白花丹醌低劑量組都出現(xiàn)纖維組織增生，肝細胞有脂肪變性，病理損害相對B組模型組均減輕，其中白花丹醌高劑量組對肝臟的保護作用大于低劑量組。E組秋水仙堿組和F組丹參酚酸B組都都出現(xiàn)纖維組織增生，肝細胞有脂肪變性，有炎癥細胞的浸潤，病理損害相對B組模型組均減輕，其中秋水仙堿組對肝臟的保護作用大于低劑量組。<

9、br>　　第二部分、白花丹醌干預前后對LSEC細胞HSPG2蛋白表達的影響
　　本部分實驗選用LSEC細胞作為白花丹醌干預肝纖維化機制的研究對象，具體原因有以下幾點：①正常分化的LSEC能夠促使活化的HSC逆轉(zhuǎn)至平靜狀態(tài)，有效地防止肝纖維化的發(fā)展。②當LSEC停止分化或者出現(xiàn)肝竇毛細血管化時，HSC的激活效應會得到允許。③當發(fā)生肝纖維化、肝損傷時，LSEC變成一種高效的促炎癥因子，并且分泌一系列的細胞因子和趨化因子，介導肝臟炎癥反

10、應加速和肝臟免疫功能改變。
　　將LSEC細胞分為7組：A組為LSEC組；B組為瘦素激活模型對照組（培養(yǎng)液中加入Leptin終濃度為100ug/L進行LSEC細胞的活化）；C1組為白花丹醌高濃度組（先用Leptin將細胞激活后，加入白花丹醌終濃度為15umol/L）；C2組為白花丹醌中濃度組（先用Leptin將細胞激活后，加入白花丹醌終濃度為8umol/L）；C3組為白花丹醌低劑量組（先用Leptin將細胞激活后，加入白花丹醌終濃

11、度為2umol/L）；D組為秋水仙堿干預對照組（先用Leptin將細胞激活后，給藥濃度為6.25ug/L）；E組為丹參酚酸B組（先用Leptin將細胞激活后，給藥濃度為10-6mol/L）
　　收集對數(shù)期生長的上述7組細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白質(zhì)，BCA法進行蛋白質(zhì)定量，取50ug/孔蛋白進行6％SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5％脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫環(huán)境下

12、，放入搖床中封閉2h，加入一抗（HSPG2和β-actin），4℃條件下過夜，加入二抗（HRP）,室溫環(huán)境下孵育2h，增強化學發(fā)光ECL顯影后，利用BandScan分析膠片灰度值。
　　結(jié)果表明：與肝竇內(nèi)皮細胞組比較，瘦素激活模型對照組中HSEG2蛋白的表達水平顯著升高(P﹤0.01)；與瘦素激活模型對照組比較，白花丹醌治療組、秋水仙堿組和丹參酚酸B組中LSEC細胞HSPG2蛋白表達水平顯著降低(P﹤0.05)，其中白花丹醌高劑量

13、組的效果優(yōu)于中劑量和低劑量組；與秋水仙堿組比較，白花丹醌高劑量組中LSEC細胞HSPG2蛋白表達顯著降低(P﹤0.05)；與丹參酚酸B組比較，白花丹醌高劑量組HSPG2蛋白表達水平偏低，比較結(jié)果有顯著性差異(P﹤0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.白花丹醌可以顯著降低血瘀型肝纖維化動物中肝功能相關(guān)指標AST、ALT、ALP等含量，有利于保護肝臟功能，減輕肝臟炎癥的發(fā)生。
　　2.白花丹醌可以顯著降低血瘀型肝纖維化動物中肝