黑曲霉內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，優(yōu)化及在畢赤酵母中的表達研究.pdf

1、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)是一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應用于飼料工業(yè)，釀造業(yè)等領域。隨著生產(chǎn)的發(fā)展，β-1，4-葡聚糖酶需求量日益增加。本實驗的主要目的就是，從分泌熱穩(wěn)定性的β-1，4-葡聚糖酶的黑曲霉高產(chǎn)菌株中，克隆該基因，利用基因工程手段實現(xiàn)高效表達，滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。 實驗首先是利用RT-PCR技術，提取黑曲霉(Aspergillusniger)L3的總RNA進行反轉錄，并通過PCR擴增得到去除天然信號

2、肽的β-1，4-葡聚糖酶基因egI，將其插入到畢赤酵母表達載體pPIC9k上，使之位于α-因子信號肽下游，并與之同框，構建重組表達質粒pPIC9k-egI，電擊轉化畢赤酵母GS115，經(jīng)MM、MD、CMC-Na和G418平板篩選，得到重組畢赤酵母工程菌1-1＃和1-5＃，在搖瓶發(fā)酵水平上，以0.5％的β-葡聚糖為底物檢測，酶活分別達到1456U/mL和1928U/mL。重組酶最適pH為5.0，最適反應溫度為70℃，在70℃時保溫30mi

3、n后仍然具有90％以上的活力。 為了進一步提高表達量，根據(jù)畢赤酵母偏愛的密碼子優(yōu)化來源于AnigerL3的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的DNA序列，共改變193個堿基，G+C％由54％下降到44.22％。設計了14對寡聚核苷酸引物，采用重疊延伸PCR三步法獲得全長基因序列共改變。將其插入到畢赤酵母表達載體。pPIC9K上，構建重組表達質粒pPIC9k-syn-egI，電擊轉化畢赤酵母GS115，經(jīng)MM、MD、CMC-Na和G418平