精卵發(fā)生特異性轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1的DNA結(jié)合序列分析研究.pdf

1、本研究運(yùn)用分子生物學(xué)基本技術(shù),擴(kuò)增目的序列,構(gòu)建pGEX-SOHLH1融合表達(dá)質(zhì)粒,并運(yùn)用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。通過純化包涵體,對(duì)包涵體內(nèi)蛋白透析復(fù)性,用GST Bind Resin親和層析純化獲得重組蛋白。最后運(yùn)用靶序列循環(huán)擴(kuò)增(The Cyclic Amplification of Sequence of Target,CAST)實(shí)驗(yàn)來確定SOHLH1的DNA結(jié)合序列。對(duì)生殖細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子sohlhl DNA結(jié)合序列的分析為進(jìn)

2、一步研究精卵發(fā)生中SOHLH1的表達(dá)調(diào)控和后續(xù)精卵發(fā)生中的基因表達(dá)調(diào)控過程奠定基礎(chǔ)。另一方面還為我們對(duì)精原卵原細(xì)胞早期分化過程進(jìn)行人為干擾提供了選擇,通過人為的干擾可以獲得一些不孕不育的動(dòng)物模型,從而為生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展提供新的研究思路。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過PCR的方法,擴(kuò)增并回收SOHLH1蛋白中螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域基因序列,將目的片段插入到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2的GST基因下游,構(gòu)建GST-SOHLH

3、1融合表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化Rosetta-gami(DE3)Plys表達(dá)菌株。通過酶切鑒定及DNA測(cè)序篩選正確的融合表達(dá)載體。通過在不同溫度、不同IPTG終濃度及不同誘導(dǎo)時(shí)間條件下對(duì)誘導(dǎo)菌體聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果的分析,得出最佳誘導(dǎo)條件。在最適條件下對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo),經(jīng)裂解、透析復(fù)性得到溶解蛋白,該蛋白經(jīng)GST Bind Resin親和層析,獲取純化后的GST-SOHLH1蛋白,并對(duì)蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。鑒定后的GST-SOH

4、LH1蛋白用于CAST實(shí)驗(yàn),通過比對(duì)CAST實(shí)驗(yàn)得到的PCR產(chǎn)物的序列,得出SOHLH1蛋白的DNA結(jié)合序列。
　　 結(jié)果：
　　 1、PCR擴(kuò)增得到的Sohlh1基因片段酶切后與pGEX-4T-2連接。通過酶切及DNA測(cè)序證實(shí)目的片段成功插入到表達(dá)載體中。
　　 2、經(jīng)驗(yàn)證重組質(zhì)粒在37℃、IPTG終濃度1mMol/L,誘導(dǎo)3小時(shí)時(shí)融合蛋白表達(dá)量最高,GST-SOHLH1融合蛋白分子量約為36KDa。
　

5、　 3、GST-SOHLH1蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)裂解、透析復(fù)性得到溶解蛋白,該蛋白經(jīng)GST Bind Resin親和層析,獲取純化后的GST-SOHLH1蛋白。
　　 4、DNA序列GACTT/G/CA出現(xiàn)頻率最高,可能是SOHLH1的結(jié)合序列。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建插入小鼠SOHLH1蛋白螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域基因序列的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-SOHLH1。
　　 2、經(jīng)CAST實(shí)驗(yàn)證明D